MYB是植物转录因子中最大的家族之一，该家族成员以含有MYB结构域为共同特征。按所含MYB结构域的数目，MYB类转录因子可分成3种类型，即分别含1个、2个和3个MYB结构域。每个MYB结构域通常由51~52个氨基酸组成，在空间结构上，MYB结构域形成螺旋-螺旋-转角-螺旋(helix-helix-turn-helix)结构，负责与DNA序列的特异结合。植物中绝大多数MYB类转录因子都含有2个MYB结构域，对应于动物c-MYB蛋白的R2和R3 MYB结构域，故称为R2R3 MYB蛋白。除具有DNA结合功能域外，大多数R2R3 MYB类转录因子还具有转录激活功能域, 它们一般位于蛋白序列的中间或C端，常以富含酸性氨基酸、脯氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸/苏氨酸为其特征(Kranz et al., 1998; Schwechheimer et al., 1998; Jin et al., 1999; Stracke et al., 2001)。目前已在多种植物中发现数目众多的R2R3 MYB基因。例如，仅在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中就有大约125个R2R3 MYB基因，在玉米(Zea mays)基因组中也存在上百个的R2R3 MYB基因。它们在植物代谢和发育的各个方面起着重要的调控作用，其主要功能是调节次生代谢(特别是苯丙酸代谢)、控制细胞的分化和器官的形态建成以及参与对环境胁迫、光和激素的应答等。但迄今关于MYB类转录因子调控植物基因表达的机制还远未阐述清楚，并且已有的研究主要集中在拟南芥、烟草(Nicotiana tabacum)和玉米等草本植物中，而林木中关于这类转录因子的研究相对滞后(Rabinowicz et al., 1999; Stracke et al., 2001; Patzlaff et al., 2003; Karpinska et al., 2004; 陈俊等，2002)。

杨树是林木研究的模式植物，关于MYB类转录因子调控其生长发育的研究已受到高度关注，并取得一定进展。Wilkins等(2009)利用生物信息学预测在毛果杨(Populus trichocarpa)基因组中存在192个R2R3-MYB基因，进而通过基因芯片分析，发现其中约有29个在雄花序中表达水平最高，另有14个左右在雄花序和雌花序中均有较高水平的表达。分离、鉴定这些与花发育相关的MYB基因可为揭示杨树花发育分子机制提供理想的切入点。

本文以黑杨派(Section Aigeiros)的欧美杨(Populus×euramericana)为研究材料，从其雄花序中分离到1个编码MYB转录因子的cDNA克隆PeMYBL1，并利用RT-PCR对该基因的表达模式进行初步分析。同时，通过与核酸、蛋白数据库的序列比对，比较该基因的同源性。此项研究工作为深入理解MYB转录因子调控机制提供新的资料。

1 材料与方法 1.1 植物材料

欧美杨样品取自鲁东大学校园，取样后立即液氮速冻，并于液氮中冷冻保存直至使用。

1.2 总RNA提取

总RNA的提取参照RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)说明书进行。

1.3 目的基因克隆及序列测定

以欧美杨雄花序为材料提取总RNA。用BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)试剂盒进行反转录，合成cDNA的第1条链。根据保守区的氨基酸序列RCGKSCR和PGRTDNE设计1对兼并引物PMYBf：5′-CGTTG(T/C)GG(A/C)AA(A/G)AG(T/C)TG(T/C)CGT-3′和PMYBr：5′-TC(A/G)TTA(T/G)C(T/G)GTTCT(T/C)CC(A/T/C)GG-3′，以cDNA为模板进行PCR，获得中间片段。PCR扩增: 94 ℃ 3 min预变性后，94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共35个循环。目的片段的克隆参照Promega公司的pGME-Teasy Vector Systems说明书进行，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

根据获得的中间片段序列，设计特异引物PMYB1-1：5′-CCTGACTTGAAGAGAGGCCT-3′，通过3′RACE PCR分离基因的3′端序列。具体操作参照BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)说明。将获得的序列在杨树的EST数据库(PopulusDB，AspenDB，PoplarDB)和NCBI数据库中运行BLASTn程序，选择比对分值最高的EST序列，找出序列一致的部分，人工拼接合并EST，最终拼接得到目的基因的5′端理论序列。最后, 在目的基因的两端设计特异引物PMYB1-2：5′-GAACTATAGTGATGGGTAGAC-3′和PMYB1-3：5′-GGTCTTGAACTCTTCTTCGAT-3′，分离全长cDNA，进行测序验证。

1.4 目的基因的序列分析

利用DNAstar、Primer Premier 5.0软件对目的基因cDNA编码氨基酸序列进行分析；用NCBI数据库中的Blast软件将目的基因编码的氨基酸序列与GenBank中的序列进行比对和相似性搜索；进而利用DNA man软件进行多序列同源性比对和聚类分析。

1.5 RT-PCR分析

采用RT-PCR半定量法对目的基因的表达模式进行分析。分别提取根、茎、叶、不同发育时期的雄花序及雌花序的总RNA。取1 μg的总RNA，用20 μL的M-MLV酶(Promega)反应体系反转录合成cDNA的第1条链。根据目的基因的3′端非保守区设计特异引物PMYB1-4：5′-AGTTGCCTATGGTCGGAGGT-3′和PMYB1-3：5′-GGTCTTGAACTCTTCTTCGAT-3′，进行PCR扩增。以肌动蛋白基因ACTIN为扩增内部参照，扩增引物为ACTINf：5′-ACCACATACAACTCCATCAT-3′，ACTINr：5′-CACCTTGATTTCCATGCTGC-3′。PCR扩增的条件为：94 ℃ 3 min预变性后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增30个循环，而ACTIN扩增26个循环，最后72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析 2.1 PeMYBL1基因的分离及序列分析

利用同源克隆方法从欧美杨雄花序中分离到1个MYB基因PeMYBL1，Genbank注册号为FJ209088。该基因cDNA全长1 094 bp，共编码276个氨基酸。图 1示PeMYBL1基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。序列分析结果显示，PeMYBL1蛋白分子质量为30.849 ku，等电点为5.4。N端具有2个典型的MYB DNA结合域：R2(12-64 aa)与R3(65-115 aa)。R2结构域自第17 aa开始，每间隔19个aa有1个保守的疏水氨基酸残基色氨酸(W，17aa, 37aa, 57aa)，共计3个W；R3结构域中第1个W为亮氨酸(L，70aa)所取代，自L起每间隔18个aa有1个W残基(89aa，108aa)。C端存在一段Ser/Thr丰富区，这是转录因子激活结构域常见的特征。此外，PeMYBL1序列的另一个重要特征是在R3结构域的下游含有1个保守的E1基序(LXXMGIDPVTHK/RP)(Ju et al., 2006)。以上结果表明，PeMYBL1编码的蛋白是一个典型的R2R3 MYB转录因子家族成员。

2.2 PeMYBL1基因的同源性比对及聚类分析

用BLASTp程序将PeMYBL1基因推导的氨基酸序列与数据库中的序列比较，发现与其同源的序列全部是MYB基因，并具有较高的序列一致性。例如，PeMYBL1与拟南芥的AtMYB85(一致性57%)、玉米的ZmMYBL1(一致性57%)、水稻的OsMYB15(一致性56%)及矮牵牛(Petunia×hybrida)的ODORANT1(一致性55%)，且同源区域都集中在N端R2R3 DNA结合域(图 2)，而C端同源性极低，说明分离得到的PeMYBL1是1个新的杨树MYB基因。

应用DNAMAN软件包中的MASED软件，对来自拟南芥、矮牵牛、水稻、玉米、金鱼草(Antirrhinum majus)、西红柿(Lycopersicon esculentum)、杨树等植物的24个MYB转录因子成员，采用Neighbor-Joining的方法进行进化树分析(图 3)，发现PeMYBL1与拟南芥的AtMYB85、玉米的ZmMYBL1、水稻的OsMYB15及矮牵牛的ODORANT1聚为同一分支，表明它们可能具有相同的起源。

2.3 PeMYBL1在不同组织中的表达分析

利用RT-PCR技术对PeMYBL1在不同组织中的表达模式进行分析。结果显示，PeMYBL1在根、茎、叶、雄花序和雌花序中均表达，但在雄花序中表达水平最高。为进一步了解PeMYBL1在雄花序的不同发育时期中的表达情况，分别提取幼嫩和成熟雄花序的总RNA进行分析。如图 4所示，随着雄花序发育成熟，PeMYBL1的表达量逐渐提高。

3 讨论

多年生木本植物是大多数森林生态系统中的主要生命形式，具有与草本植物不同的解剖学、生理学及遗传学特性，因此以木本植物为材料开展对MYB转录因子家族新成员的分离、鉴定对深入理解该类转录因子的调控机制具有独特的价值(Bradshaw et al., 2000; Taylor, 2002)。杨树由于其基因组较小，且具有完善的遗传转化体系，已成为研究林木遗传、发育及基因工程改良的模式植物。同时，杨树基因组计划及一系列EST计划的完成也将为研究其生长和发育规律提供理想平台(Brunner et al., 2004；Sterky et al., 2004; 张勇等, 2006)。本研究从欧美杨分离到1个R2R3 MYB基因PeMYBL1，该基因编码的蛋白具有典型的MYB转录因子的序列特征。目前，正在进一步通过检测PeMYBA1::GFP融合基因的表达情况及一系列的缺失分析确定PeMYBL1的亚细胞定位情况和蛋白不同区段的转录激活活性。

植物MYB转录因子较明确的功能之一是参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节(Yang et al., 2001; Deluc et al., 2008; Laitinen et al., 2008; Nakatsuka et al., 2008)。Paz-Ares等(1987)从玉米中发现第1个植物MYB基因C1。研究表明，C1与顺式作用元件相结合，调控花青素生物合成途径中相关基因的表达，作用于种子糊粉层色素形成过程。而花青素便是通过一条苯丙烷代谢通路产生的。随后，人们发现许多R2R3 MYB家族成员也在苯丙烷代谢途径的调控中发挥重要作用。例如：矮牵牛的PhMYB3, 金鱼草的AmMYB305, 豌豆的PsMYB26以及玉米的ZmMYB1等基因可以调节花器官中花青素和类黄酮合成的水平(Franken et al., 1994; Solano et al., 1995; Moyano et al., 1996; Uimari et al., 1997)，而玉米的ZmMYBPL则在营养器官中行使类似的功能(Cone et al., 1993)。与上述基因的表达产物不同，Verdonk等(2005)报道的矮牵牛中MYB转录因子ODORANT1则通过调节莽草酸途径调控挥发性芳香族化合物的生物合成。系统进化分析将PeMYBL1同ODORANT1聚在同一分支中，这为推测PeMYBL1的功能提供一定的线索。RT-PCR分析显示，PeMYBL1雄花序中表达水平远远高于其他被检组织中的表达量，且随着雄花序发育成熟，PeMYBL1的表达量逐渐提高，暗示该基因与雄花发育密切相关。尽管序列同源性分析和基因表达模式常常作为推测基因功能的重要标准，但是功能分析才能最终说明它在植物发育过程中的作用，因此，今后将构建PeMYBL1表达载体，通过同源和异源转化对该基因的功能进行鉴定。对PeMYBL1的分离鉴定及进一步的功能研究将为更全面、深入地了解该基因家族的功能提供新资料。