当植物受到昆虫或致病菌的侵害时，植物体内化学成分的种类和数量均会发生变化，从而对昆虫和致病菌产生忌避作用和抑制作用。这些变化包括营养物质含量、比例的改变以及次生代谢的增加，如植物被诱导产生高浓度的萜烯、酚、单宁、生物碱、蛋白酶抑制剂等他感化合物(allelochemical)。植物次生代谢物(plant secondary metabolites)曾一度被认为是代谢的废弃物。然而随着研究的深入，发现次生代谢物在植物的生命活动中扮演重要的作用，而且广泛地应用于工业、医药卫生等方面。已有研究证明，当松树受害后，其树体内的营养物质、挥发性及非挥发性次生物质在含量上均会发生不同程度的变化，表现为：营养物质可溶性糖含量下降，各次生代谢物质(单宁、酚类物质)含量增加，从而达到防御松毛虫的目的(李镇宇等, 1999; 王燕等, 2000)。

萜类化合物(terpenoids)是植物次生代谢物中的一类重要化合物，许多萜类化合物被植物用于防御外来植食性害虫和其伴生致病真菌的侵害，同时也是针叶树的重要防御物质。目前已知针叶树萜类化合物能够被某些植食性昆虫诱导生成。如白松木蠹象(Pissodes strobi)取食云杉(Picea asperata)后，可导致(-)-芳樟醇的释放量增多(Miller et al., 2005)。萜类化合物在针叶树中通常以复杂的混合物形式存在，其数量和特性，特别是其对映体组成，会影响萜烯类化合物对潜在的致病菌和植食性昆虫的防御作用。萜类化合物具有重要的生态作用，特别是单萜化合物在寄主的识别选择、信息素信号(引导小蠹虫聚集和侵殖)及3层营养关系中具有不可替代的作用。除此之外，萜类化合物对蛀干蠹虫还有一定的毒性作用(Phillips et al., 1999b; Trapp et al., 2001a)。如柠檬烯和3-蒈烯均可通过与其他生物活性因子协同作用来阻碍昆虫的侵害(Raffa et al., 1983)。目前，萜类化合物已成为针叶树研究领域中的热点问题。

萜类合成酶(terpene synthases, TPS)是萜类化合物生物合成过程中的关键酶之一。TPS分别催化前体底物香叶酯二磷酸(geranyl diphosphate，GPP)、法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)形成单萜、倍半萜和二萜。目前，在针叶树中已报道了70多种TPS，包括50多个核苷酸序列(表 1)。已报道的针叶树TPS主要集中在松科(Pinaceae)植物中，其中以大冷杉(Abies grandis)居多，挪威云杉(Picea abies)次之，而火炬松(Pinus taeda)、北美云杉(Picea sitchensis)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、红杉(Abies magnifica)只占少部分。对萜类合成酶及其编码基因的深入研究，可以使我们通过DNA重组技术来改造萜类合成细胞中的代谢途径，以提高萜类最终产量或在不含萜类的生物中合成萜类，为促进有用萜类合成提供新的机会(黄瑛等, 2006)。如通过对紫杉醇生物合成途径中关键酶基因的分离、克隆并对其进行基因改造和遗传转化，构建高效表达紫杉醇或其重要前体紫杉烷的基因工程细胞株，并建立其相应的基因表达调控方法，从而解决紫杉醇的药源问题。本文对国内外针叶树萜类合成酶方面的研究做一综述，从而为我国油松(Pinus tabulaeformis)在这方面的研究工作提供有益的参考。

1 萜类合成酶的理化特性

大多数萜类合成酶都是可溶性的酸性蛋白，天然分子质量在35~80 ku之间，其催化反应依赖2价金属阳离子(如Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺等)(Phillips et al., 1999a; Trapp et al., 2001a; 2001b)，反应底物主要是以GPP, FPP和GGPP为主(图 1)。

萜烯合成酶根据其功能可以分为3大类，分别是单萜合成酶(monoterpene synthase)、倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase)和二萜合成酶(diterpene synthase)。其中单萜合成酶的等电点值(isoelectric point, pI)大约在pH 6左右，其最佳pH范围在6.8~7.8之间。通常裸子植物的萜烯合成酶要比被子植物的萜烯合成酶偏高些(Bohlmann et al., 1998a; 1998b)。

裸子植物单萜合成酶的催化作用不仅依赖2价金属离子(但更偏好Mn²⁺)，而且还需要单价阳离子(如K⁺)来激活，该特性是被子植物单萜合成酶所不具有的(Bohlmann et al., 1997)。裸子植物单萜合成酶的最适pH值为碱性(Bohlmann et al., 1997; Lewinsohn et al., 1992; Savage et al., 1994)，而被子植物的最适pH值接近中性(Alonso et al., 1991; Croteau et al., 1979; 1980; Gambliel et al., 1982; Hallahan et al., 1988; Poulose et al., 1978)。

1.1 萜类合成酶在细胞区室化

所有的萜类化合物都共有一个共同的前体—异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)。IPP在IPP异构酶的作用下形成二甲丙烯焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMADP)，IPP和DMADP在异戊烯基转移酶的作用下形成GDP、FDP和GGDP(图 1)。这些非环化的中间体在萜类合成酶的作用下形成各种闭环的萜类物质。通常单萜来自于GDP、倍半萜来自于FDP、二萜来自于GGDP，故萜类合成酶通常也称为环化酶。

研究发现萜类化合物生物合成有2条分别独立的途径，即甲羟戊酸途径(mevalonate pathway, MVA)(Chappell, 1995)和丙酮酸途径(DXP)(Eisenreich et al., 1998; Lichtenthaler, 1999)。这2条合成途径分别在细胞溶质(cytosolic)和细胞质体(plastids)中形成5C单位的IPP和DMAPP，从而使得萜烯的生物合成具有区室化的特点。与FPP生物合成、倍半萜和三萜合成有关的酶主要在细胞溶质中，而负责异戊二烯(isoprene)、单萜、二萜和四萜形成的酶主要位于细胞质体中(Tholl, 2006)。每个部分都有IPP异构酶和异戊烯基转移酶，都可以独立完成相关萜类的生物合成。

1.2 萜类合成酶的多样性

在3大类萜类合成酶中，大部分萜类合成酶的产物是唯一的。然而有少数萜类合成酶则不然，如大冷杉的(-)蒎烯合成酶能够产生(-)-α和(-)-β蒎烯。虽然每一类酶的底物相同，然而同一种酶在不同植物中的产物却不尽相同(Bohlmann et al., 1998a; 1998b)。如烟草(Nicotiana tabacum)倍半萜环化酶产物是5-epi-马兜铃烯，而在棉花(Gossypium hirsutum)中相应酶的产物是(+)-δ-杜松烯(Bohlmann et al., 1998a; 陈晓亚等, 1996)。同一种萜类合成酶能够产生多种产物(Phillips et al., 1999a; Savage et al., 1994)。比如，从大冷杉中分离出的2种萜烯合成酶γ-h蛇麻烯合酶和δ-桉叶烯合酶(Steele et al., 1995; 1998)，在异源表达后可分别产生34种和52种倍半萜。

2 结构特征 2.1 基因结构

在各种萜类合成酶的核酸序列中，其内含子和外显子的位置分布大致一致，因而其酶蛋白表现出较高的同源性。图 2是植物中萜类合成酶基因的一般结构示意图(Trapp et al., 2001b)。

研究揭示，植物的萜类合成酶有相似的反应机理、保守的基因结构和序列特征，包括同源的氨基酸序列、保守序列功能域(即保守序列基序)、内含子数量和外显子的大小，因而是由一个共同的祖先进化而来(Trapp et al., 2001b)。通过分析不同的萜类合成酶基因序列，萜类合成酶似乎发生了一连串内含子和内部基因序列的丢失。萜类合成酶的祖先可能与古老的松类二萜合成酶类似，其保守区至少包含12个内含子和l3个外显子。一般说来，内含子丢失越多，进化程度则越高。近来有研究对分属6个基因亚家族的裸子植物和被子植物的33种萜类合成酶的氨基酸序列进行分析，结果表明，参与初生代谢和次生代谢的萜类合成酶的分支，发生在被子植物与裸子植物分离之前(Bohlmann et al., 2000)。裸子植物的萜类合成酶基因形成了相对独立的家族，并且与被子植物的萜类合成酶存在着差异。

利用反义基因方法并根据其氨基酸序列的相关性，萜类合成酶基因又可分为6类(依据最低同源性不得低于40%)，它们分别是Tpsa, Tpsb, Tpsc, Tpsd, Tpse, Tpdf(Bohlmann et al., 1998a; Keeling et al., 2006; Trapp et al., 2001b)。Tpsa包括被子植物的倍半萜和二萜合成酶; Tpsb主要包括被子植物唇形科(angiosperms of the Lamiaceae)的单萜合成酶; Tpsd包括11种裸子植物单萜、倍半萜和二萜合成酶; 从序列比对和系统发育树构建来看，裸子植物的萜烯合成酶形成了一个独立的分支(Bohlmann et al., 1998a)，即Tpsd。Tpsc、Tpsf和Tpse则与Tpsa、Tpsb、Tpsd有较远的亲缘关系。有研究表明，Tpsd基因家族还可根据系统发生学进行亚分类，Tps-d可分为：Tps-d1、Tps-d2、Tps-d3(Keeling et al., 2006)。它们分别包括主要的单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶。针叶树TPS基因在TPS-d1、TPS-d2和TPS-d3亚家族中表现出高度的核酸序列相关性(Byun-McKay et al., 2006)。

2.2 氨基酸结构

通过对几个萜类合成酶晶体结构X线-衍射研究发现，萜类合成酶大多具有相似的蛋白3维结构。萜类合成酶通常具有2个非常明显的结构域，即酶蛋白的C-末端活性区域和N-末端活性区域。这2个结构域在结构上类似糖基水解(glycosyl hydrolysases)反应的核心。在C-末端活性位点区域，萜类合成酶含有1个富含天冬氨酸的DDXXD基序(motif)。该基序被认为与2价金属阳离子和酶底物连接有关(Lesburg et al., 1997)，是酶的催化活性中心。该基序在进化上高度保守，通过与底物质子化而启动反应。而在N-末端活性位点区域，萜类合成酶则含有基序RRX₈W。

以柠檬烯合酶为例，其氨基酸序列上有2个和功能相关的保守域。第1个保守域是在58, 59位的连续2个精氨酸(R58，R59)，它出现在所有的单萜合成酶序列之中(Williams et al., 1998)。不过也有例外，如最近发现的香叶醇合成酶则没有RR单元(Iijima et al., 2004)。缺失第1个或者替换第2个精氨酸残基都会使柠檬烯合成酶完全失去利用GPP的能力。深入研究表明：R58和R59可能与GPP离子－异构化形成(3S)-LPP有关。第2个保守域是DDxxD，该保守域为整个萜类合成酶共有，并且也存在于异戊烯基转移酶中，推测是二磷酸脂的结合部位。

单萜合成酶由600~650个氨基酸组成(Bohlmann et al., 1997; 1998a; Keeling et al., 2006)，比倍半萜合成酶多50~70个氨基酸。其原因是单萜合成酶定位于质体中，而倍半萜合成酶定位于细胞质中，故单萜合成酶需要一个N-末端转移肽定向与质体结合(图 3)(Keeling et al., 2006)。这些“多余”的氨基酸序列位于高度保守的RR片断的氨基端上游，但并非单萜合成酶活性所必需。它们虽然在一级结构上差异很大，但都具有丝氨酸和苏氨酸含量高、酸性氨基酸含量低的特点。而在RR片断的下游，单萜合成酶的氨基酸序列具有明显的相似性，因此RR片断为成熟蛋白的氨基端起始的大概位置。

由于多出一个在序列和位置上均相对保守的内部元件，大多数二萜合成酶又比单萜合成酶长出大约210个氨基酸(Bohlmann et al., 1998a)。在所有二萜合成酶中，该插入片断位于氨基端活性结构域，在序列和位置上相当保守，可能与环化机制有关，但不直接起催化作用，而可能与稳定、结合和控制有关，具体情况尚不清楚。

3 催化机制

萜类合成酶的催化机制首先是各种底物在相应萜类合成酶的催化下，进行亲电性的异构化-环化反应(Cane et al., 1991; Lesburg et al., 1997)。以单萜为例，GDP在2价金属离子协助下被离子化，解离形成烯正碳离子与焦磷酸基负离子的离子对，然后与酶结合，重排形成异构体LDP(3R-or 3S-linalyl diphosphate，取决于GDP底物的起始折叠构象)，经旋转成顺式构象，接着LDP离子化并进行亲电子攻击双键富电碳原子而环化，生成相应的4R-或4S-α-松油烯正碳离子(α-terpinyl cation)。由这一中间体，通过加成、重排和进一步环化等多条路线，形成不同的单萜化合物。所有的单萜合成酶均能催化以上异构化和环化反应，并且这些一系列离子对的反应步骤均发生在酶的相同活性位点上。亲电子异构化-环化反应决定了单萜的骨架类型、立体异构体和衍生物。只有少数单萜合成酶催化生成链状产物如月桂烯和芳樟醇。

4 调控

萜类合成酶的活性常常会受到外界因素的影响，如创伤、蛀干害虫及其伴生的致病性真菌的侵害和各种激素类化学物质均能影响萜类合成酶的活性。研究证明，萜类合成酶活性是在基因转录水平上受到控制(Tholl, 2006)。用甲基茉莉酸酯(MeJA)处理挪威云杉后，MeJA能够诱导树脂道形成，同时诱导萜类合成酶的活性增高和萜烯化合物积累。其原因是MeJA能够诱导树干组织中单萜合成酶和二萜合成酶转录水平的暂时增加(Fäldt et al., 2003)。白松木蠹象抗性树和易感树在单萜、倍半萜、二萜合成酶组成性表达上均没有什么差异。但是在创伤后的16天之内，抗性树与易感树的单萜合成酶和倍半萜合成酶在转录水平上表现出显著性差异。创伤都能导致抗性树和易感树的萜类合成酶在转录水平上的增加。创伤后6 h，萜类合成酶的转录水平就开始增加，并在创伤后的第4到7天达到最高，而且在第7天的时候，抗性树与易感树间的差异最显著。创伤16天后，萜类合成酶的转录水平开始降低(Byun-McKay et al., 2006)。萜类合成酶基因的诱导表达也可以在白松象鼻虫攻击锡特卡云杉(Picea sitchensis)的树干部后见到(Tholl, 2006)。

单萜、倍半萜和二萜合成酶都能受到创伤的诱导，从而导致转录水平的变化(Steele et al., 1998)。不过它们之间的反应时间有差异。单萜合成酶的mRNA积累发生在创伤2 h内，通常在2~4天达到最大值。二萜合成酶的基因诱导表达类似单萜合成酶，但时间延后。而(E)-α-红没药烯合成酶的mRNA水平在创伤后12天才达到最大值。萜类合成酶基因诱导表达的时间反应不同与相应萜烯化合物的防御作用相一致，即有毒性的单萜在小蠹虫攻击后立即释放，二萜树脂酸在延后一些动员。

昆虫是已知的能够诱导针叶树萜烯类化合物增加的因素之一。太平洋黄松(Pinus ponderosa)针叶的单萜合成酶活性，黑松(Pinus contorta)、白冷杉(Abies concolor)针叶的单萜合成酶活性在虎蛾幼虫取食后增加(Litvak et al., 1999)。白松木蠹象取食西岸云杉(Picea sitchensis)后能够诱导一些萜烯合成酶转录体的表达，如(-)-Pinene synthase(催化(-)-α-Pinene和(-)-β-Pinene的生物合成)(McKay et al., 2003)。西岸云杉针叶中的(-)-Linalool synthase基因诱导表达进一步证明了活性的挥发物释放是由于应激压力诱导的结果(Keeling et al., 2006)。

5 展望

萜烯合成酶的研究从单个酶的研究进入到萜类合成酶系统的研究。大冷杉已成为针叶树在这方面的研究的模式物种。我国针叶树资源丰富，特别是油松为我国的特有物种，具有广阔的应用价值。怎样利用生物工程技术，来改造油松，提高其抗逆性和改善其生产性能，是一个重要的课题。相信随着萜类合成酶的深入研究，人们将会弄清楚萜类化合物在生态系统中的作用机制，为更好地利用这些植物次生代谢物提供基础，特别是调控酶基因的各种调控因素，还需要进一步深入研究。

由于针叶树的生长周期长，这给研究带来了很大的阻力。另外，针叶树的次生代谢物如多糖、多酚等较多且繁杂，也给研究工作带来了许多困难。如何克服这些困难，需要人们借助许多其他学科的研究方法，如分子、细胞生物学、基因芯片、蛋白质组学等研究手段。