水果采后腐烂的主要原因有病原菌侵染、机械损伤和生理失调，其中病原菌侵染在水果腐烂占主导地位。长期以来，使用化学保鲜剂控制果蔬的采后腐烂一直被认为是最有效的方法，然而随着病原菌抗药性的逐渐增强, 消费者对果蔬质量要求不断提高和环保意识的加强，人们开始注意到化学防腐保鲜剂的潜在危险，消费者对采用化学保鲜剂处理过的果蔬抵制情绪越来越高。生物杀菌剂既能减轻有害微生物对果蔬侵染，又能保护环境，是生产安全性食品的有效方法，因而研究天然生物杀菌剂取代农药进行果蔬采后病害的防治，对减少食品中农药的残留，保护环境，确保人体健康，都具有重要意义。有关果实生物保鲜已有一些报道(陈功友等, 1993; 张福星等, 2000; Soliva-Fortuny et al., 2003; Ghita et al., 2004; Mokbel et al., 2005; 黄运红等, 2006; Arroyo-Lopez et al., 2006)，特别以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的应用较多，它是自然界中广泛存在的非致病菌，对人畜无害，不污染环境，为“公认安全(GRAS)”的细菌。许多研究工作者已经从土壤、植物根际和植物体内分离到了大量有益的枯草芽孢杆菌，这些菌株中有些会对植物病原菌产生抑制、诱导植物产生抗病物质，有些还会对植物有促生作用，是人们普遍关注的1类生防菌(Uric et al., 2004; Ngugi et al., 2005; 齐东梅等, 2005)。国内外许多枯草芽孢杆菌开发的生物农药己经上市。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，我国研究者也分离到了许多有较好防病效果的枯草芽孢杆菌(杨佐忠等, 2006)。多项研究都证明利用拮抗微生物来控制病害是具有很大潜力的新兴技术。血橙(Citrus sinensis)的生物保鲜方面研究较少，本文报道了枯草芽孢杆菌水溶性代谢产物及对血橙防腐保鲜的研究结果。

B. subtilis接种于PD液体培养基中，28 ℃下培养120 h，经5 000 r·min^-1离心后用0.45 μm微孔滤膜过滤上清液，得培养物滤液(CF，下称滤液)。将B. subtilis滤液用灭菌蒸馏水10倍梯度稀释，以PD培养基滤液(MF)的相应浓度作对照。每浓度重复3次，分别接种生长3日的Penicillium sp., Alternaria sp.(血橙腐烂病菌)菌落边缘菌丝块(ϕ=5 mm)，25 ℃下培养120 h，菌丝经灭菌水冲洗数次后于100 ℃烘干至恒重，测定各处理对上述菌株的生物量。

定量融化并冷却至42~45 ℃的PDA与定量的B. subtilis滤液均匀混合，制成含不同浓度滤液的PDA平板(ϕ=9 cm), 以含对应浓度的培养基滤液及不含滤液的PDA平板为对照，每个浓度重复3次。各平板中央接种3日菌龄的Alternaria sp.菌落边缘菌丝块(ϕ=5 mm)，25 ℃下培养至不含滤液的PDA平板中相应的菌株满皿时，测量各处理中病菌的菌落直径。

参照Mckeen (1986)的方法，取B. subtilis的24 h肉胨斜面培养物接种于200 mL产抗生素培养基中，28 ℃培养96 h后其发酵液经20 000 r·min^-1、-4 ℃离心25 min，用浓盐酸调节上清液至pH2.5~2.0，再经18 000 r·min^-1, -4 ℃离心30 min，其沉淀物用80%乙酸乙酯和丙酮交替浸提数次，每次10 min，2 500 r·min^-1离心除去上清液，沉淀即为B. subtilis代谢产物的粗提物，将提取物溶于80%乙醇中，4 ℃下保存备用。

将含B. subtilis代谢产物粗提物的80%乙醇液点样于20 cm×20 cm的新华Ⅰ号层析滤纸上，分别用乙醇:水=2:1(v/v)和正丁醇:冰醋酸:水=3:1:1(v/v/v)溶剂系统作单向层析，室温或冷风干燥后用紫外分析仪视检并计算各分离斑(带)的R_f值，剪下分离带及带间滤纸分别用2 mL 80%乙醇浸提，然后将浸提液经过滤灭菌后接种同质等量Penicillium sp., Alternaria sp.的菌块，25 ℃下培养170 h后测定各自生物量，以确定各组分的抑菌活性。将同样的层析结果喷洒0.2%茚三酮酒精液，显示确定各组分的反应性质。

以Sephadex G25(100~200目)为层析凝胶，B. subtilis的滤液为样品，重蒸馏水为洗脱液。层析柱柱径:柱长=1:40，床体积40 mL，上样量2.0 mL，洗脱速度4 mL·(15 min)^-1，分部收集，收集量为每管4 mL。UV-1800紫外可见分光光度仪测定不同洗脱体积在280和260 nm处的光密度值并用与测定纸层析成分相同的方法测定具不同光密度洗脱液的抑菌活性。

B. subtilis制剂按杨佐忠(1993)方法生产。防腐保鲜试验设以下处理: 1)CK；2) 1倍B. subtilis生物制剂稀释液浸果；3) 5倍B. subtilis生物制剂稀释液浸果；4) 10倍B. subtilis生物制剂稀释液浸果；5) 20倍B. subtilis生物制剂稀释液浸果；6) 100倍B. subtilis生物制剂稀释液浸果；7) 1倍B. subtilis生物制剂(灭活)稀释液浸果；8) 阿斯匹林；9) 阿斯匹林+5倍B. subtilis生物制剂稀释液浸果。3次重复，每重复30个样品。处理前后称重，计算失重率。另设1组试验测试生物制剂处理时间对血橙防腐作用的影响，设以下处理: 1) CK；2) CK(聚乙烯薄膜包膜)；3) 10%B. subtilis处理5 s；4) 10%B. subtilis处理4 h；5) 10%B. subtilis处理8 h；6) 10%B. subtilis处理12 h；7) 10%B. subtilis处理4 h+聚乙烯薄膜包膜；8) 10%B. subtilis处理8 h+聚乙烯薄膜包膜；9) 10%B. subtilis处理12 h+聚乙烯薄膜包膜；10) 2, 4-D；11) 施保克；12) 国光保鲜剂。3次重复，每重复30个样品。定期统计血橙腐烂情况，处理前后称重，计算失重率。

液体培养和琼脂平板菌落直径法测定B. subtilis培养滤液对血橙果腐病菌(Penicillium sp., Alternaria sp.)影响的结果表明: B. subtilis滤液抑制Penicillium sp., Alternaria sp.生长的有效浓度为0.1%以上，其中滤液原液对上述2种病菌的抑制率分别高达80.0%, 93.1%，表明B. subtilis滤液中存在对血橙果腐病菌有抑制作用的生物活性物质。

纸层析(表 1, 2)和凝胶层析(图 1)结果表明：B. subtilis的水溶性代谢物中至少有3组分活性物质，其中2组分为含量较少的大分子物质(图 1，b和c峰；表 3，组分Ⅰ和Ⅱ)，另一组分系含量较大的小分子物质(图 1，a峰；表 3，组分Ⅲ)；但2种病菌对3组分物质的敏感性有差异，Alternaria sp.对3组分物质均敏感，Penicillium sp.对组分Ⅱ和Ⅲ敏感。

表 1 B. subtilis代谢产物粗提物的纸层析及抑菌活性^① Tab.1 Inhibition activity and paper-layer for antibiotic crude from B. subtilis

表 1 B. subtilis代谢产物粗提物的纸层析及抑菌活性① Tab.1 Inhibition activity and paper-layer for antibiotic crude from B. subtilis

表 2 组分Ⅲ浓度与抑菌的关系^① Tab.2 Relation between composition Ⅲ concentration and its antibiotic

表 2 组分Ⅲ浓度与抑菌的关系① Tab.2 Relation between composition Ⅲ concentration and its antibiotic

图 1 培养滤液的凝胶层析曲线 Figure 1 Gel filtration chromatograghy profile

表 3 血橙小区防腐效果 Tab.3 Control effect of blood orange plot preservation

表 3 血橙小区防腐效果 Tab.3 Control effect of blood orange plot preservation

B. subtilis生物制剂浓度越高，防腐效果越好，血橙失水率越低，如将制剂稀释到20~100倍，相对防效将从15.2%降至7.4%，一般以1~10倍效果相对较好。B. subtilis热处理后，相对防效下降33.6%，而阿斯匹林与B. subtilis生物制剂联合作用可提高防效28.8%(表 3)。由表 4可知:生物制剂处理时间对血橙防腐作用的影响，在8h内，随着处理时间增长，防效增加，一般以4~8 h效果最佳。如将生物制剂与包膜技术相结合，则进一步提高防效，减少失重率，增加可食性，可与化学保鲜剂2，4-D、施保克、国光保鲜剂防效相当。

表 4 B. subtilis处理时间对血橙防腐作用的影响 Tab.4 Effect of B. subtilis treating time on blood orange plot preservation

表 4 B. subtilis处理时间对血橙防腐作用的影响 Tab.4 Effect of B. subtilis treating time on blood orange plot preservation

田间应用研究己经证实芽孢杆菌生防菌剂在产品中的稳定性，与化学农药的相容性和不同植物不同年份防效的一致性方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌。近年来，枯草芽孢杆菌在水果采后病害防治上也取得了一些进展，Pusey等(1984)用B.subtilis B-3菌株对多种收获后水果进行防腐保鲜试验，成功控制了由褐腐病菌Monilinia fructicola引起的桃(Prunus persica)、李(P. salicina)和杏(P. armeniaca)等核果类水果的腐烂病。利用该抗生体果蜡、氯硝胺联合防治桃褐腐病的中间试验效果与优良杀菌剂相当，接近实用化水平。Vapinder等(1984)用从柑桔果实上分离到的B. subtilis抗生体有效地控制了由Alternaria citri，Geotriichum及Penicillium digitatum等引起的柑桔(Citrus reticulata)果腐病，防效达60%以上。Pusey等(1984)用枯草芽孢杆菌产生的伊枯草菌素抑制引起核果采后腐烂的褐腐病菌的生长。本研究表明: B. subtilis菌株可产生拮抗Penicillium spp., Alternaria spp.代谢物质，其中水溶性物质中至少有3组分有效抑菌物质，这可能是B. subtilis的主要防腐保鲜机制之一，这与杨佐忠等(1993; 2003)的研究有些类似。B. subtilis菌株产生的3组分有效抑菌物质对果品2种腐烂菌的抑菌作用有差异，Alternaria spp.对3组分物质均敏感，Penicillium spp.对组分Ⅱ和Ⅲ敏感，表明了这种广谱性抗生菌的抗生作用仍具一定的选择性。

B. subtilis是1种广谱性的抗生菌(Pusey et al., 1984; Vapinder et al., 1984)，其防效与2，4-D、施保克、国光保鲜剂等化学制剂相当。以B. subtilis基础制作的保鲜剂，其防腐效果为活菌与代谢产物的共同作用，活菌在血橙表面在繁殖并不断产生本研究中所涉及的代谢物，将对血橙防腐有持续效果，这一现象已在其他研究中得到证实(Jacxsens et al., 2003)。如要获得较好的保鲜效果应综合采取多种技术手段，如低温、包膜以及涂抹防腐剂等，如何保障在贮藏条件下的防治效果成为生防菌商品化生产的关键。包膜或成膜处理果实是生物制剂防腐保鲜的重要组成部分，包膜不仅能阻止果实水分的快速散失和病菌飞散，还能有效阻隔腐烂果实与健康果实的接触感染。不同果实需要不同的包膜，反之，不同性质的包膜应用于同样果实，其保鲜效果差异较大(杨佐忠等, 2006)。另外，生防菌与不同的包膜结合使用防效也不相同。