自Molisch(1937)首次提出植物化感作用以来, 化感问题受到广大学者的重视。迄今为止所发现的化感物质中酚酸类物质具有较强的化感活性, 成为植物化感研究最多的一类物质(Inderjit, 1996; Rimando et al., 2001; Tsutomu, 2001)。有学者认为, 酚酸物质在根际土壤中的逐渐累积可对林木产生较强的自毒作用, 并造成土壤微生态环境改变, 进而引发地力衰退(Fisher, 1980; Jeffrey et al., 2004; 林思祖等, 1999; 马祥庆等, 2000; 梁文举等, 2005; 林文雄等, 2007)。在杉木(Cunninghamia lanceolata)、桉树(Eucalyptus)、马尾松(Pinus massoniana)等树种的连作人工林中酚酸物质的化感效应问题已被有关研究证实(马越强等, 1998; 黄志群等, 2000; 汪思龙等, 2002; 陈龙池等, 2002；2003;曾任森等, 1997; 李延茂等, 2005; 曹光球等, 2005; 王晗光等, 2006)。但目前尚缺少它们在人工林地产生和累积机制的有关研究。人工林地土壤中酚酸物质的累积取决于林地内诱导这些物质产生的土壤条件以及土壤对酚酸的吸附和降解能力, 其中酚酸在土壤胶体上的吸附和降解特性是决定酚酸在土壤中归趋(fate)的重要因素(Dalton et al., 1989; Inderjit, 2004), 关于酚酸的环境行为学问题也逐渐受到有关学者的重视。

杨树(Populus)生长迅速、木材优良、用途广泛, 是工业人工林定向培育最适宜的树种之一, 目前已成为我国长江流域及黄淮海地区最重要的速生丰产林树种。迄今为止, 我国的杨树人工林已经有连作3代林、4代林, 个别地方甚至出现连作5代林, 地力衰退现象非常严重(王华田等, 2007; 刘福德等, 2005)。为探讨杨树人工林地力衰退的实质, 谭秀梅等(2008)采用HPLC对不同连作代数杨树根际土进行分析, 检测到强化感物质对羟基苯甲酸、苯甲酸等酚酸物质在根际土中的累积。本研究在此基础上, 开展了对羟基苯甲酸和苯甲酸2种酚酸在杨树根际土壤中的吸附和解吸附特性研究, 以期为揭示这2种化感物质在杨树根际微域的累积机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

1) 供试土壤  取自山东省泰安市宁阳县高桥林场1代(Ⅰ)、2代(Ⅱ)、3代(Ⅲ)、4代(Ⅳ)美洲黑杨(Populus deltoides)速生丰产林, 试验样地位于大汶河沿岸河滩阶地, 土壤为粗沙质河潮土, 颗粒较粗, 保肥保水性差, 有机质含量较低。于7月采集土样, 在每种林分内设置3个标准地, 在每个标准地内随机抽取3株平均木, 距树干基部0.5 m处呈梅花形分布设置5个取样点, 挖取0~50 cm土层中直径小于0.5 cm的杨树根系, 采集细根上粘附的土壤, 充分混合后装入已消毒的密封塑料袋中带回实验室。各林地根际土壤基本理化性质见表 1。

2) 试剂  对羟基苯甲酸、苯甲酸(色谱纯)购自上海化学试剂公司, 甲醇、冰乙酸、乙腈等试剂均选用色谱纯。

1.2 方法

1) 土壤处理  将土壤样品风干后碾细, 过60目筛(孔径0.25 mm), 置于高压灭菌锅灭菌1 h。

2) 酚酸标样制备  分别准确称量10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0 mg对羟基苯甲酸和苯甲酸, 混合后置于烧杯, 用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中, 形成2种酚酸质量浓度梯度为100, 200, 300, 400, 500 μg·mL^-1的混合标准液。

3) 色谱条件  美国Thermo Fisher Scientific高效液相色谱仪, PDA紫外检测器, 色谱柱Diamnsil C18, 流动相乙腈(A)和双蒸水(B)(用冰乙酸调pH值至2.8), 检测波长为280 nm, 柱温25 ℃, 采用自动连续梯度洗脱设置：0 min开始时A:B为6%:94%, 45 min后为72%:28%；进样量10 μL, 流速为1.0 μL·min^-1。

4) 2种酚酸标样质量浓度与峰面积标准曲线的绘制  采用外标法定量测度对羟基苯甲酸和苯甲酸质量浓度与图谱峰面积的关系。将2种酚酸混合标样进行色谱分析, 分别以2种酚酸的峰面积和标样质量浓度作图, 通过线性回归得到2种酚酸质量浓度和图谱峰面积的线性方程:

对羟基苯甲酸, Y＝-314 170+51 685.1X, R²=0.982;

苯甲酸, Y＝272 430+14 083.4X, R²=0.984。拟合方程中, Y表示色谱峰面积, X表示酚酸标样质量浓度(μg·mL^-1)。

5) 吸附和解吸附试验  等温吸附试验：各称取5.00 g不同代数人工林林地灭菌干燥根际土样4份, 分别置于4只100 mL锥形瓶中, 分别加入50 mL质量浓度为100, 200, 300, 400 μg·mL^-1的对羟基苯甲酸和苯甲酸标准液, 于25 ℃条件下恒温振荡24 h, 静置30 min后, 吸取上清液2 mL置于离心管, 室温以4 000 r·min^-1离心10 min, 取清液用0.25 μm滤膜过滤, 后进行色谱分析。

等温解吸试验：吸附完成后的土壤样品溶液抽取10 mL上清液, 然后加入10 mL去离子水, 使溶液体积保持在50 mL, 在25 ℃条件下恒温振荡24 h, 静置30 min, 吸取上清液2 mL置于离心管, 离心(条件同上), 取清液用0.25 μm滤膜过滤, 上液相色谱测定。

1.3 数据处理

1) 酚酸的吸附能力：根据加入标准液的初始质量浓度和吸附平衡液中酚酸质量浓度之差计算土壤对酚酸吸附量和吸附率。

(1)

(2)

式1, 2中, C_s表示单位质量土壤吸附的酚酸量(μg·g^-1)；C_o表示酚酸的初始质量浓度(μg·mL^-1)；C_e表示吸附平衡液中酚酸的质量浓度(μg·mL^-1)；V表示溶液的体积(mL)；M表示土壤样品的质量(g)；R_s表示酚酸的吸附率。

2) 酚酸的吸附热力学特征：为清晰表明对羟基苯甲酸和苯甲酸在连作杨树根际土壤中的吸附行为, 本研究应用Fruendlich吸附等温方程式模拟了2种酚酸在不同代数人工林根际土壤中吸附热力学特征。

(3)

式3中, C_s意义同上；K_d是在一定温度下一定量化感物质-吸附剂结合常数, 即吸附平衡常数；1/n为拟合方程系数。

3) 酚酸的解吸附能力：用解吸率表示解吸的难易程度, 在数值上为解吸量占吸附量的百分数。

(4)

(5)

式4, 5中, R_d表示酚酸解吸率；C_s^*表示解吸平衡后土壤对酚酸的吸附量；C_e^*表示解吸平衡后样品溶液中酚酸的质量浓度；C_s, C_e意义同上。

4) 土壤对酚酸吸附的自由能变化：

(6)

式6中, △G表示土壤吸附时的自由能变化(kJ·mol^-1), R为常数(8.309 J·mol^-1), T为绝对温度(273.15 K), K_oc为单位土壤有机质的吸附常数(K_oc＝K_d/土壤有机质含量)。

2 结果与分析 2.1 不同林地杨树根际土壤对2种酚酸的吸附作用

从表 2中可以看出, 不同代数杨树根际土壤对苯甲酸和对羟基苯甲酸均具有较强的吸附能力, 对羟基苯甲酸的平均吸附率在63.39%~72.26%之间, 苯甲酸的吸附率较对羟基苯甲酸低, 平均吸附率在39.53%~47.46%。因此, 对羟基苯甲酸和苯甲酸在杨树根际土壤中均较容易被吸附, 且土壤对对羟基苯甲酸的吸附能力高于苯甲酸。吸附量定量表征了单位质量土壤对酚酸的吸附能力。随2种酚酸初始质量浓度的增加, 其在不同代根际土壤中均出现吸附量增加的现象, 这是大多数分子型有机物被土壤胶体吸附呈现的一致特点。不同代数杨树根际土壤对2种酚酸的吸附能力变化趋势基本一致, 即随连作代数的增加, 土壤对酚酸的吸附量变大, 这可以很好解释随连作代数增加2种酚酸在杨树根际土壤中的含量亦明显增加的规律。

2.2 2种酚酸在不同林地杨树根际土壤中的等温吸附特性

从表 3中可以看出, 对羟基苯甲酸和苯甲酸在不同代数杨树根际土的等温吸附用Fruendlich方程拟合后, 拟合方程系数1/n大都在0.80~1.10之间, 相关系数r大都在0.97以上, 相关性显著或极显著水平, 说明此方程能很好地描述2种酚酸在杨树根际土中的吸附过程, 吸附平衡质量浓度C_e和吸附量C_s之间存在较好线性关系(图 1)。

此外, 从表 3中可以看出, 2种酚酸的吸附常数K_d在不同根际土壤中差异较大, 这可能与各自的土壤性质存在关系。对2种酚酸的吸附常数K_d与土壤理化性质进行多元线性回归, 回归方程如下:

对羟基苯甲酸：Y₁＝-524.67+2.592X₁-2.691X₂+94.845X₉, R²=0.897;

苯甲酸：Y₂=-976.305+519.548X₁+13.195X₂+4.538X₉, R²=0.863。

式中, Y₁、Y₂分别为对羟基苯甲酸和苯甲酸K_d值, 因子X₁, X₂, X₉指标同表 1。

从回归方程可以看出, 虽然2种酚酸在杨树根际土壤中的吸附高度依赖于土壤中有机质的含量, 但也受根际土壤中金属离子含量的影响。其中, 对羟基苯甲酸K_d值变化规律与土壤中Mn含量的变化呈现一致规律, 苯甲酸K_d值变化与土壤中有机质含量的变化呈现一致规律(图 2)。

2.3 2种酚酸在不同林地杨树根际土壤上的吸附自由能变化

土壤吸附时的自由能变化是反映土壤吸附特性的重要参数, 根据吸附自由能变化的大小, 可以推断土壤的吸附机制, 当自由能变化小于41.84 kJ·mol^-1时为物理吸附, 反之为化学吸附(蔡道基, 1999)。从表 4中可以看出, 对羟基苯甲酸和苯甲酸在根际土中的吸附自由能变化范围分别为-9.27 kJ·mol^-1< △G < -4.95 kJ·mol^-1和-10.43 kJ·mol^-1< △G < -4.51 kJ·mol^-1, 2种酚酸在杨树不同林地根际土壤中的吸附均属于物理吸附。由于物理吸附到达吸附平衡的速度较快, 而且在某种因素影响下该吸附是可逆的, 因此2种酚酸在杨树根际土壤中的吸附作用可能较为迅速, 并同时伴有解吸现象。

2.4 2种酚酸在不同林地根际土壤中的解吸特性

为研究对羟基苯甲酸和苯甲酸在杨树根际土壤中的解吸特性, 本研究进行了2种酚酸在根际土壤溶液中的等温解吸试验。从表 5中可以看出, 对羟基苯甲酸在各代根际土吸附平衡液中的解吸能力均较强(平均解吸率46.62%~52.89%), 而苯甲酸解吸能力较弱, 尤其在高质量浓度吸附平衡体系中很难进行解吸附, 这一规律与2种酚酸在不同代数根际土壤中的吸附常数基本一致。说明对羟基苯甲酸淋溶后能增加土壤中自由态的含量, 从而增加其在土壤中的移动性, 同时亦增加了其在土壤中的化感潜能；苯甲酸则相反, 一旦被土壤胶体吸附后很难进行解吸附, 这一方面限制了其在土壤中的移动, 另一方面使其在土壤中大多以束缚态形式存在。有研究表明, 化感物质进入土壤后, 由于受土壤吸附作用的影响通常形成自由态(free)、可逆束缚态(reversibly bound)和完全束缚态(bound)3种形式(Rice, 1984), 而自由态和可逆束缚态的化感物质是真正具有化感活性(bioavailability)的部分, 处于可逆束缚态的化感物质在外界因素的影响下将脱离土壤胶体的结合位点而转变为自由态从而具备化感潜能。

3 讨论

1) 酚酸类物质在土壤中的累积与其吸附和解吸行为关系密切。以往研究表明, 自然状态下植物根系分泌的化感物质极少, 不足以发挥化感效应(Birkett et al., 2001)。此外, 由于受土壤微生物降解作用和土壤胶体吸附作用的影响, 具有化感活性的物质在土壤中的质量浓度是极其微小的, 甚至其存在是短暂的。化感效应发挥必须建立在化感物质一定质量浓度基础之上, 这在很多受控试验中都得到证实。因此, 化感效应发挥的前提是化感物质的累积, 这一过程不但与植物根系分泌化感物质的强度有关, 而且强烈地受到土壤中微生物活动(Blum et al., 1988; 张淑香等, 2000)及土壤胶体吸附能力的影响以及与化感物质本身的特性有关。化感物质在土壤中的累积机制是化感效应研究中值得关注的问题, 化感物质在土壤中的环境行为特征研究成为揭示化感物质累积机制的重要内容。其中, 对化感物质在土壤中的吸附和解吸附行为的研究可为这个问题的解决提供重要的理论依据。本研究针对杨树连作人工林根际土壤中呈明显累积的2种酚酸(对羟基苯甲酸和苯甲酸), 通过其在不同代数根际土壤中的吸附特性研究, 结果表明对苯甲酸和对羟基苯甲酸在不同代数杨树根际土中均具有较强的吸附能力, 对羟基苯甲酸的平均吸附率在63.388%~72.258%之间, 苯甲酸在杨树根际土中的吸附率较对羟基苯甲酸低, 平均吸附率在39.525%~47.463%。等温吸附试验表明, 2种酚酸在不同代数根际土壤中的吸附平衡浓度C_e和吸附量C_s之间存在较好线性关系, 拟合方程系数大都在0.80~1.10之间, Fruendlich等温吸附方程能很好描述2种酚酸在杨树根际土中的吸附过程, 并能很好解释2种酚酸在根际土壤中的吸附规律。2种酚酸的解吸附特性表明, 对羟基苯甲酸在各代根际土的吸附平衡溶液中的解吸能力均较强, 平均解吸率在46.62%~52.89%之间；而苯甲酸解吸能力较弱, 尤其在高质量浓度吸附平衡体系中很难进行解吸附, 此规律与2种酚酸在不同代数根际土壤中的吸附常数变化规律基本一致。以上结论在一定程度上可以较好解释2种酚酸在杨树根际微域的累积机制, 即对羟基苯甲酸在杨树根际土壤中较容易被吸附, 且该吸附属于可逆吸附, 当遭受淋溶后能迅速增加土壤中自由态的含量, 同时增加了其在土壤中的化感潜能；而苯甲酸被土壤胶体吸附后很难进行解吸附, 使其在土壤中大多以束缚态形式存在, 降低了土壤中具有化感潜能的自由态的含量。因此, 应用常规HPLC法对不同代数杨树根际土进行检测时会发现对羟基苯甲酸的累积量明显高于苯甲酸(谭秀梅等, 2008)。虽然有学者针对某些酚酸类化感物质在土壤中的吸附特征进行了一些探讨(Cecchi et al., 2004), 但基于化感物质本身的性质以及研究方法和技术的局限, 对化感物质的环境行为学特征及其影响因素认识不足, 尚难形成对酚酸物质累积机制的清晰认识。目前, 在环境科学领域, 针对农业生产中的某些常用除草剂, 如乐斯本(chlorpyrifos, 又名毒死稗)、阿特拉津(atrazine, 又名莠去津)、草甘磷(glyphosate, 又名镇草宁)、二甲戊灵(pendimethalin, 又名杀草通)等以及某些有毒重金属元素(铜、铅、镉)在环境中的累积问题, 从其在土壤及水体中的环境行为角度开展研究较多(郭观林等, 2005; 王平等, 2007; 刘松长等, 2007), 由此形成了较为完善的有毒物质环境化学行为的理论体系和研究方法。因此, 关于化感物质的累积机制研究今后应该更加注重借鉴环境科学领域的研究方法。

2) 酚酸类物质在土壤中吸附和解吸行为受多种因素的影响。有研究表明, 酚酸在土壤中的吸附机理非常复杂, 虽然现有的试验数据仅能够说明有限的几个化感物质吸附位点, 但试验结果均表明土壤胶体对化感物质的吸附可能会通过静电吸附、离子交换吸附、范德华力吸附、有机物之间的疏水结合和氢键结合、配体交换等多种方式进行(Lehmann et al., 1987; McBride, 1987), 不同的吸附机制决定了其吸附能力和解吸能力。土壤胶体性质与酚酸的吸附密切相关, 有研究发现锰氧化物能够增加土壤对酚酸的吸附(Lehmann et al., 1988), 铁氧化物也有类似的促进作用(Makino et al., 1996), 本研究的结果也重现了这一结论。Cecchi等(2004)的研究结果表明对羟基香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、香草酸以及对羟基苯甲酸等5种酚酸在土壤中的吸附和解吸附高度依赖于有机质含量、酸碱性(pH值)、金属氧化物含量及黏粒含量等土壤特性, 同样其吸附机制亦非常复杂, 不能仅仅从土壤的某一特性进行判断。Inderjit等(2004)研究了沙壤土(sandy loam)和沙壤土+壤质沙土(loamy sand) 2种土壤对苯甲酸的吸附特性, 结果表明土壤中的粒径组成、有机质含量、pH值、金属离子含量等很多因素都会影响苯甲酸的吸附能力。此外, 酚酸在土壤胶体上的吸附与其本身的分子结构和性质有关, 例如肉桂酸衍生物在土壤中的吸附强于苯甲酸衍生物(Dalton et al., 1989; Haider et al., 1975; Lehmann et al., 1987), 而酚酸环状结构上的甲基氧基团或丙烯酸侧链可以增强它们在土壤中的吸附。

可见, 化感物质在土壤中的环境行为受多种因素的影响, 关于对羟基苯甲酸和苯甲酸在不同代数杨树根际土壤中的累积机制有待于进一步深入研究。