木兰科鹅掌楸属(Liriodendron)树种现存2种, 一种为天然分布于美国东部和加拿大东南部的北美鹅掌楸(L.tulipifera), 另一种为星散分布于我国长江以南及越南北部的鹅掌楸(L.chinense)。自1963年我国已故林木遗传育种学家叶培忠教授成功获得杂交鹅掌楸以来, 南京林业大学先后培育出一批杂交鹅掌楸优良家系与无性系, 经过40余年的试验研究, 证实了杂交鹅掌楸具有非常强的杂种优势。与2个亲本种相比, 杂交鹅掌楸表现出速生、花色艳丽、抗逆性强、适应性广、几乎无病虫害等优点, 是极佳的园林绿化及珍贵用材树种(王章荣, 2005)。迄今为止, 杂交鹅掌楸已在江苏、福建、湖南、浙江、江西、山东、湖北、湖南、贵州、云南、北京等地区推广, 产生了巨大的经济和社会效益。随着人们对杂交鹅掌楸利用价值的不断认识, 其推广应用规模也越来越大。但目前杂交鹅掌楸苗木市场混乱, 存在以假乱真现象, 因此, 生产上急需一种方便、准确、可靠的杂交鹅掌楸鉴别方法。

传统的杂交鹅掌楸鉴定主要依据其与两亲本种在形态(刘洪谔等, 1991)、解剖(叶金山等, 1997)和同工酶酶谱(黄敏仁等, 1979)等方面的差异。但形态特征在苗期差异并不明显且受环境影响较大, 同工酶标记受基因表达的限制而影响其使用。分子标记的迅速发展为物种鉴别提供了很好的手段, 李周岐等(2001)用RAPD分子标记构建了杂交鹅掌楸的无性系指纹图谱, 但RAPD分子标记存在稳定性与重复性差等缺陷。与其他分子标记相比, SSR具有共显性遗传、重复性与稳定性好、多态性高等优点, 是亲本分析、物种/品种鉴别较理想的遗传标记(孙亚光等, 2007; 王琼等, 2008; 杨彦伶等, 2008)。本文报道了鹅掌楸、北美鹅掌楸及杂交鹅掌楸SSR分子标记的物种特异性鉴定方法。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验材料分2批, 一批用来筛选鹅掌楸物种特异性SSR引物, 另一批用来验证该引物的物种特异性。以鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂交鹅掌楸各30个基因型作为筛选物种特异性SSR引物的试验材料, 其中, 鹅掌楸来自20个种源, 北美鹅掌楸来自5个种源, 杂交鹅掌楸来自30个交配组合, 每个交配组合随机抽取1个基因型。30个交配组合分别为:密苏里×浙江松阳、密苏里×江西庐山、密苏里×福建武夷山、密苏里×安徽黄山、南卡1×湖南桑植、南卡2×湖南桑植、南卡×浙江松阳、南卡×江西庐山、南卡×浙江富阳、南卡1×贵州思南、南卡2×贵州思南、南卡×福建武夷山、北卡×安徽黄山、北卡×浙江松阳、北美×路易斯、北美×江西庐山4、北美×江西庐山5、北美×浙江富阳、路易斯×江西庐山1、路易斯×重庆酉阳、路易斯×江西庐山、路易斯×浙江富阳、路易斯×浙江松阳、佐治亚×福建武夷山、佐治亚×浙江富阳、浙江松阳×佐治亚、浙江松阳×南卡、浙江松阳×北卡、安徽黄山×路易斯以及江西庐山×路易斯(数字表示不同的基因型)。具体情况见表 1。

以鹅掌楸10个基因型、北美鹅掌楸5个基因型、杂交鹅掌楸10个基因型共25个基因型用来验证引物特异性, 其中, 鹅掌楸来自云南麻栗坡与湖南城步2个种源, 每种源各取5个基因型, 北美鹅掌楸来自加拿大安大略种源, 杂交鹅掌楸来自1对正反交组合(浙江松阳×北美, 北美×浙江松阳), 每组合各取5个基因型。对上述每个基因型样品采集新鲜无病斑嫩叶数片, 放入-70 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法 1.2.1 总DNA的提取

鹅掌楸基因组DNA的提取采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法(张博等, 2004)。

1.2.2 引物来源及SSR-PCR反应条件和PCR后处理

所用的176对SSR引物源于南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室从北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物(Xu et al., 2006)。

PCR的反应体系10 μL, 包括模板DNA 25 ng, 10×Buffer 1 μL, 10 mmol·L^-1 dNTPs(上海捷瑞生物有限公司)0.2 μL, 2 5 mmol·L^-1 MgCl₂ 1 μL, F-primer 0.25 μL, R-primer 0.25 μL, Ampli Taq Gold(上海捷瑞生物有限公司)0.05 μL, ddH₂O 6.25 μL。PCR反应程序为:预变性94 ℃ 4 min; 梯度降温扩增, 94 ℃ 15 s, 60 ℃[>50.5(-0.5 ℃/cyc)] 15 s, 72 ℃ 30 s, 15个循环; 一般性扩增, 94 ℃ 15 s, 49.5 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s, 15个循环; 延伸72 ℃ 1 h和最终的保存4 ℃。所用的PCR仪为APPLIED BIOSYSTEMS GeneAmp PCR system 9700。然后对P CR产物加等体积上样缓冲液, 8%变性聚丙烯酰胺凝胶[100 mL凝胶包括42 g尿素, 20 mL 40%丙烯酰胺和N, N’亚甲双丙烯酰胺(质量比为19:1), 0.5 mL 10%过硫酸铵, 50 μL TEMED, 10 mL 10×TBE电泳缓冲液], 120 V稳压电泳1~2 h后固定染色; 固定10 min(固定液10%乙醇, 0.5%乙酸), ddH₂O漂洗2次每次2 min; 再用0.15%硝酸银染色7 min, 双蒸水漂洗2次, 每次2 min, 最后显影(1.5%氢氧化钠, 0.756%四硼酸钠, 1%甲醛)至条带清晰, 然后对扩增片段大小进行判断。

2 结果与分析 2.1 引物筛选

随机选取鹅掌楸、北美鹅掌楸各4个DNA样品, 对176对引物进行PCR扩增。淘汰无扩增产物和多态性差的引物, 选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物, 最后筛选出带型清晰、重复性好、稳定性高、种内一致性较高、种间差别明显的引物8对(图 1)。然后, 用鹅掌楸(来自2 0个种源)、北美鹅掌楸(来自5个种源)和杂交鹅掌楸(来自30个交配组合)各30个基因型对引物进行再次筛选, 最终筛选出1对特异性引物001。

2.2 物种特异性扩增

筛选出的鹅掌楸物种特异性SSR引物, 其序列为:5’-CCGAACGATATAAAGTGAG-3’; 5’-GTAGGTTTGAGGGAAGAGG-3’。该对引物在鹅掌楸中特异性扩增出190 bp的产物, 在北美鹅掌楸中特异性扩增出180 bp的产物, 在杂交鹅掌楸中特异性扩增出180 bp和190 bp 2种产物(图 2)。

2.3 引物特异性验证

以来自云南麻栗坡、湖南城步的鹅掌楸, 来自安大略的北美鹅掌楸, 以及1对正反交组合子代, 共25个基因型(表 2), 用以验证该引物特异性扩增的稳定性及物种鉴别的准确率。结果显示, 该对引物在10个鹅掌楸基因型中特异性扩增出190 bp的产物, 在北美鹅掌楸5个基因型中特异性扩增出180 bp的产物, 在10个杂交鹅掌楸正反交组合子代中均特异性扩增出180 bp和190 bp 2种产物(表 2)。可见, 该对引物的物种特异性鉴别准确率达100%, 且稳定性高, 是鹅掌楸属物种鉴别的理想遗传标记。

3 讨论 3.1 SSR标记用于鹅掌楸属种及杂种鉴别的优点

本试验筛选出的1对鹅掌楸种特异性SSR引物, 为鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸的鉴定提供了一种快速、简便、稳定、可靠的方法。与原有的杂交鹅掌楸鉴定方法(如形态特征、RAPD分子标记)相比, 该方法具有两大优点:1) 结果准确可靠。先后对来自22个种源的鹅掌楸、6个种源的北美鹅掌楸以及32个交配组合的杂交鹅掌楸共115个基因型进行检测, 该对引物在所有基因型中均为特异性扩增, 其物种鉴定的准确率达100%, 表明该物种特异性引物具有很高的重复性与稳定性。2) 操作简便快速。仅需1对引物, 通过对样品进行DNA提取与纯化、PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后即可判断结果, 无需对扩增的产物进行限制性内切酶酶切, 整个检测过程可在6 h内完成。

3.2 鹅掌楸SSR种特异性引物的应用前景

由于杂交鹅掌楸杂种优势强、观赏性好、适应性广, 市场前景广阔。但目前杂交鹅掌楸苗木市场混乱, 存在以假乱真现象。鹅掌楸SSR物种特异性引物的筛选为杂交鹅掌楸的鉴别提供了一种方便、准确、快速、可靠的方法。另一方面, 由于鹅掌楸属种间可配性高, 不存在生殖隔离, 随着北美鹅掌楸的大量引种栽培及杂交鹅掌楸的推广应用, 必然导致鹅掌楸种间基因渐渗, 进而影响我国濒危树种鹅掌楸遗传系统的完整性, 因此, 开展鹅掌楸种间基因渐渗研究有重要的理论与实践意义。种间基因渐渗是植物遗传学与进化生物学的重要课题, 利用SSR分子标记可从分子水平上检测基因渐渗现象。例如庞朝友等(2006)利用15对SSR分子标记证明了8种野生棉(Gossypium)的遗传成分向陆地棉(G.hirsutum)有不同程度的渗入。由于缺少物种特异性分子标记, 因而无法确定双亲对杂交群体的贡献大小, 导致该领域研究进展缓慢(Yeh et al., 1986; Bennuah et al., 2004)。鹅掌楸物种特异性引物的开发为鹅掌楸种间渐渗杂交研究开辟了新的途径。利用该物种特异性引物可从DNA水平快速检测鹅掌楸种间渐渗杂交状况, 判断基因渐渗方向, 估算渐渗效应大小, 为鹅掌楸遗传资源保护策略制定提供依据。