核糖体RNA基因(rDNA基因)是真核生物基因组中一类高度重复并有转录活性的基因家族。rDNA基因的相对物理位置和多拷贝基因位点数目对于构建物理图谱和研究种系发生是非常重要的，它与核仁组织形成区关系密切，认识rDNA在不同物种基因组中位点的分布和拷贝数差异对研究物种进化具有重要意义(轩淑欣等，2007)。通过荧光原位杂交技术对rDNA进行染色体物理定位，可以为核型分析提供一个稳定有效的细胞学标记。禾本科rDNA的物理定位研究结果表明，小麦族的普通小麦(Triticum aestivum)、黑麦(Secale cereal)、簇毛麦(Dasypyrum villosum)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)、大麦(Hordeum vulgare)(Reddy et al., 1989; Mukai et al., 1990; 闫玲等，2000；裴自友等，2002)，水稻属(Oryza)中的栽培稻和野生稻，以及高粱(Sorghum vulgare)、玉米(Zea mays)等同属或不同属的种间(Appels et al., 1980; 龚志云等，2002)，rDNA基因在位点和数目上存在着差异。

竹类植物是禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)植物的总称，全世界约有70余属1 200余种，其中在中国分布的约有40余属500余种，变种变型100余种；全国竹林面积约500多万hm²，占森林总面积的4%。我国竹种和竹林面积约占世界的1/4。根据竹鞭的延伸性质，可以将竹类植物分为散生竹、混生竹和丛生竹3种类型。散生竹和混生竹染色体数目比较恒定，一般为2n=48；丛生竹染色体数目变化较大，一般为2n=70±2，但同时也有2n=64, 80, 96, 98及104等类型的竹种存在；竹类植物被认为是一个典型的多倍体复合体(李秀兰等，1999；2001；陈瑞阳等，2002)。由于竹类植物多为中小染色体，特别是丛生竹，染色体数目多而且染色体在形态上比散生竹更小，单靠经典的细胞遗传学手段难以对它的各条染色体加以识别，这在一定程度上限制了竹类植物细胞遗传学方面的研究。目前关于竹类植物染色体基数及倍性问题还存在着争议(Darlington et al., 1945; 李秀兰等，1999；2001)，利用荧光原位杂交技术对特异序列在竹类植物染色体上进行物理定位的研究在国内外尚未见报道。本研究选用7种常见的散生、混生和丛生竹种为材料，应用荧光原位杂交技术，对45S rDNA在这7个竹种有丝分裂中期染色体上的分布进行物理定位，通过比较45S rDNA在基因组中的分布特点及拷贝数差异，旨在为竹类植物基因组结构分析及染色体倍性的确定提供信息，为特定染色体的识别提供细胞学位标，同时也为竹类植物系统演化过程中染色体的形态变化积累分子细胞遗传学资料。

1 材料与方法 1.1 材料

日本矮竹(Sasa pygmea, 2n=48)和铺地竹(S. argenteastriatus)通过组培获得新根，毛竹(Phyllostachys edulis, 2n=48)、斑竹(Ph. bambusoides f. lacrima-deae, 2n=48)、茶秆竹(Pseudosasa amabilis, 2n=48)、菲白竹(S. fortunei, 2n=48)、白绿竹[Bambusa oldhamii(W), 2n=70±2]栽植在浙江林学院翠竹园。采集当年母竹鞭上抽出的新根或者笋下面的新根根尖作为压片材料。

1.2 方法 1.2.1 根尖细胞(RTC)染色体制片

将采集的根尖在0℃冰水中预处理22~24 h后，用卡诺氏固定液(3份95%乙醇:1份冰乙酸V/V)固定。2~7天后在45%乙酸中压片，在Olympus BX51生物显微镜下观察，取有中期分裂相的制片，置－70℃冰箱冷冻，冷冻揭片经无水乙醇脱水6 h，气干备用。

1.2.2 制片预处理

将脱水气干后的制片置于RNA酶Ⅰ溶液中37℃酶解1 h；转入胃蛋白酶溶液中，37℃酶解10 min；然后置于4%多聚甲醛溶液中，室温处理10 min；70%→95%→100%酒精中梯度脱水各3 min；气干，备用。

1.2.3 探针标记

来源于水稻的45S rDNA探针由南京农业大学王秀娥教授提供。通过缺口平移法用地高辛(Digoxigenin-11-dUTP, 德国Boehringer Mannheim公司)标记。

1.2.4 荧光原位杂交及检测

有丝分裂中期染色体荧光原位杂交及检测参照Jiang和Gill (1993)和Chen等(1995)的方法。主要包括用标记的45S rDNA作探针，杂交信号经抗地高辛抗体-荧光剂FITC (anti-dig- FITC)或者罗丹明检测，染色体通过DAPI (4', 6-diamidine-2’-phenylindole dihydrochloride)或者PI (Propidium iodide)进行套染，在Olympus BX60正置荧光显微镜100倍油镜下观察，并用Olympus DP70照相装置拍照。放大倍数均为200倍。每个材料选取10余个细胞的观察结果进行分析。

2 结果与分析 2.1 45S rDNA在散生竹种染色体上的分布

毛竹和斑竹在分类学上都属于散生竹，染色体数目为48，用45S rDNA作探针进行荧光原位杂交，在毛竹和斑竹有丝分裂中期染色体上均检测到1对染色体有杂交信号(图版Ⅰ-1, 图版Ⅰ-2，箭头所示)，且都位于随体染色体短臂核仁组织区(nuclear organizer region, 简称为NOR)。

2.2 45S rDNA在混生竹种染色体上的分布

茶秆竹、菲白竹、日本矮竹和铺地竹在竹子分类学上属于混生竹。FISH研究显示45S rDNA基因在上述4个竹种染色体上的分布与散生竹种的毛竹、斑竹相似，也都位于1对随体染色体的核仁组织区(图版Ⅰ-4, 5, 6, 7)。

2.3 45S rDNA在丛生竹种染色体上的分布

白绿竹在竹子分类学上属于丛生竹绿竹属。45S rDNA基因位点在白绿竹上的分布明显区别于上述的散生和混生的几个竹种。白绿竹染色体上有3对清晰可见和1对非常微弱的杂交信号。在目前试验条件下，这1对微弱的杂交信号重复性较差，能否确认为45S rDNA位点还需要进一步的试验来验证。在这相对清晰的3对信号当中，其中1对位点信号很强，另外2对次之(图版Ⅰ-3)。上述结果说明45S rDNA在白绿竹不同染色体上拷贝数差异比较大。同时在染色体形态上还可以看出，相对于上述的散生和混生竹种，丛生的白绿竹染色体明显小得多。

3 讨论

荧光原位杂交(FISH)是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织上定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术(Eisenstein, 2005)，它可以将功能基因、重复序列等目标DNA片段直接定位在染色体上(Jiang et al., 1994)。FISH技术现已成为研究基因组结构、功能和进化的重要手段之一，并在染色体物理作图、染色体精细结构分析和外源基因染色体整合等领域发挥着重要的作用(徐延浩等，2007)。目前，对于竹类植物染色体的研究仍然局限在核型分析、染色体计数等初级细胞学水平(Darlington et al., 1945; 李秀兰等，1999；2001；陈瑞阳等，2002)。由于竹类植物染色体数量较大，多为中小染色体，核型分析难以获得准确的涉及个别染色体的细胞学资料，染色体识别更加困难。本研究首次将FISH技术用于竹类植物细胞学研究，将核糖体基因首次物理定位于竹类植物的染色体，为竹类植物细胞遗传学研究的开展提供了第一手资料。

核仁组织区是细胞分裂不可缺少的结构，通常1个物种至少有1对同源染色体具有核仁组织区，核仁组织区一旦缺失，植物细胞将分裂异常，植物体将不能生存(刘大钧，1998)。本研究结果表明，毛竹、斑竹等散生竹和茶秆竹、菲白竹、日本矮竹和铺地竹等混生竹种均在随体染色体的核仁组织区保留了1对45S rDNA分布位点，说明上述物种保持了物种生存必需的最低核仁组织区数目。陈瑞阳等(2002)通过核型分析发现毛竹、斑竹及茶秆竹仅有1对随体染色体，本研究结果与其一致。另一方面，选用的菲白竹、铺地竹及日本矮竹、毛竹、茶秆竹为染色体数目一致的(2n=48)不同的种，有的甚至为不同的属，但45S rDNA分布情况基本相同，说明不同属的竹种、同一属的不同竹种在45S rDNA多态性上表现单一。相对于以往其他禾本科植物的研究结果，如45S rDNA在小麦族(Triticeae)各属间、属内不同种间染色体上的分布和拷贝数普遍存在较大差异(Leitch et al., 1992; Kanazin et al., 1993; Brown et al., 1999; Li et al., 2004)，竹子似乎表现出特殊的单一性。最近毛竹基因组结构研究(genomic survey sequence, GSS)结果表明：毛竹基因组中重复序列含量比较低，仅占全基因组的23.3%，比玉米65.7%的重复序列要低得多(Gui et al., 2007)。另外在开发毛竹微卫星的研究中还发现不同的毛竹个体(包括栽培类型)间微卫星的多态性非常低，刚竹属(Phyllostachys)的不同的竹种间的微卫星多态性也不高(数据未发表)。这些结果表明毛竹这类散生竹种的基因组中重复序列含量少，与毛竹、斑竹等竹种的45S rDNA分布位点单一是一致的。

在许多物种中，45S rDNA位点不仅存在于随体染色体，也存在于某些非随体染色体上，但拷贝数一般较少。这个现象在异源多倍体物种中表现较为突出，如小麦、鹅观草(Roegneria kamoji)等(徐川梅等，2007)。本文研究结果表明，45S rDNA在白绿竹上的分布情况与异源多倍体物种小麦、鹅观草情况相似，除了随体染色体上有1对最强信号位点外，在非随体染色体端部也有强度不同的45S rDNA基因位点存在，只是不同染色体上的表达量有差异。产生这一现象的原因可能是在竹类植物进化的过程中涉及倍性、染色体结构等变异，如多倍体化、染色体缺失、易位等，导致多倍体化过程中，原始物种染色体随体丢失，从而成为端NOR染色体，或者由转座子引起的屏蔽rDNA拷贝数的扩增也会造成45S rDNA数目改变。

关于竹类植物的染色体基数及倍性问题，目前仍存在分歧。最初的研究认为竹类植物和水稻(Oryza sativa)一样，染色体基数为x=12，2n=48的散生竹和2n=70±2的丛生竹分别为四倍体和六倍体(Darlington et al., 1945)；后来李秀兰等(2001)在丛生竹中发现了染色体数目分别为2n=104和2n=64的竹种，这用Darlington和Janaki (1945)的竹亚科植物染色体基数x=12理论无法解释，因此推断竹亚科植物染色体基数为x =8, 2n=48的散生竹是六倍体，2n=72的丛生竹是九倍体，2n=64, 96, 104依次为八、十二、十三倍体(李秀兰等，1999；2001)。用1个染色体基数很难解释竹类植物的染色体倍数。D'Hont等(1998)根据核糖体rDNA基因在不同种属的甘蔗(Saccharum)染色体上的分布位点数目，确定甘蔗有x=8和x=10这2种染色体基数。竹类植物是否与甘蔗相似，也是多基数多倍体呢？或者有些竹种本身就是一些非整倍体(竹类植物多是无性繁殖，非整倍体可以保存下来)，用1个染色体基数根本就解释不通呢？这些问题都需要竹类植物细胞遗传学手段的提高才会逐步得以解决。