酸雨的加剧促使污染废弃物和尾矿中含有的大量重金属活化强度加大，进一步加重了重金属的污染程度，导致土地抛荒，山林衰退(张健等，1999)。因此，研究重金属对木本植物的影响和筛选抗性较强的木本植物，通过种植木本植物既达到绿化荒山、保水固土和吸收、富集山地土壤中的重金属，修复山地土壤的目的很重要。马尾松(Pinus massoniana)对土壤中的重金属具有一定的吸收、富集作用(方晰等，2004)。目前，酸雨与铝的复合污染对马尾松的影响的报道主要集中于生长和形态特征分析方面(柳若安等，1995；杜晓明，1994)。有关铝胁迫对草本植物生理生化特性的影响，国内已有许多报道(彭艳等，2006；刘鹏等，2005；刘尼歌等，2007)，但是马尾松对酸雨与铝的复合污染的遗传变异、生理生化变化和抗性机理，还尚未见到报道。本文拟开展这方面的研究，为指导马尾松在的污染矿区的荒山造林和进一步开展马尾松的抗性选择育种提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 马尾松苗木的培养

马尾松种子由福建省林业厅种苗站提供。氯化铝采用国产分析纯。选择饱满、大小均匀的马尾松种子浸种24 h，播种于湿沙中(沙子先用3%HCl溶液浸泡1周，用流水冲洗干净，再用去离子水漂洗后，烘干备用)24 ℃恒温培养，每隔3天浇1次Hoagland营养液(连兆煌，2002)，中间酌情补充水分。将萌发的种子和幼苗按照试验的不同要求分别进行胁迫处理。所有试验的每个处理重复3次，对照均采用去离子水处理。

1.1.2 胁迫处理液的配制

1) 酸雨母液配制：酸雨与铝复合处理液根据下列福州市1999—2002年天然降水中阴阳离子浓度4年均值，配置酸雨母液(表 1)。

参照我国已出现的最大降雨酸度(pH 2.1)以及福建厦门最大降水酸度(pH 3.04)，按闽南天然酸雨中硫酸根与硝酸根离子含量的摩尔比SO₄^2-:NO₃^-=5:1，用HI99104型酸度计测定pH值，配制pH为5.6，4.5，3.5，2.5的模拟酸雨。

2) 用pH值为5.6的去离子水配制浓度为100，1 000，2 000，3 000 mg· L^-1的单一氯化铝溶液。

3) 用pH值分别为5.6，4.5，3.5，2.5的模拟酸雨配制成1 000 mg·L^-1的酸雨-铝复合处理液。

1.2 试验方法 1.2.1 胁迫处理下马尾松幼苗根尖细胞的微核和核仁变化

待马尾松种子幼根长至约0.5~0.8 cm时，进行不同的胁迫处理24 h，微核率的测定采用(吴若菁等，2 007)的方法。核仁制片采用(李懋学等，1991)的方法，每个处理随机观察200个左右的细胞，3次重复。所有观察采用YS100型Nikon显微镜。

1.2.2 胁迫条件下马尾松生理生化指标的变化

待苗高4 cm时挖取长势一致的马尾松幼苗移植于统一规格的花盆中，用上述不同pH值的酸雨和去离子水分别将氯化铝配制成复合处理液，使沙培盆栽中Al的污染水平分别处于：100，1 000，2 000，3 000 mg·L^-1，对马尾松幼苗进行胁迫处理。每盆每隔24 h喷洒1次处理液，每隔3天浇1次Hoagland营养液，处理7天后，取样测定各项生理生化指标，每处理测定3次。

MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法(王晶英等，2003)；质膜透性的测定采用电导率仪法，伤害度=(处理电导率-空白电导率)/(煮沸电导率-空白电导率)(李合生等，2001)；SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)还原法(李合生等，2001)；POD含量的测定采用愈创木酚法(张志良等。2003)。

1.2.3 胁迫条件下马尾松体内铝含量与化学态分析

用pH 5.6的去离子水配制浓度为1 000 mg·L^-1的单一氯化铝溶液和用pH值分别为5.6，4. 5，3.5，2.5的模拟酸雨配制成1 000 mg·L^-1的酸雨-铝复合处理液对苗高4 cm的马尾松幼苗进行处理，每6天喷洒25 ml处理液，每隔3天浇1次Hoagland营养液，培养1个月后，收获植株并进行分析。

对马尾松根和叶内的铝采用逐步提取法，提取剂及提取顺序为：NaCl(1 mol·L^-1 )，NH₄Ac(1 mol·L^-1，pH4.8)。分别称取2 g根或叶新鲜样品，剪成1 mm碎段，置于烧杯中，加入37.5 ml提取剂, 在30 ℃恒温箱中放置过夜(17~18 h)，次日回收提取液，再加入同样体积该提取液，浸取2 h后回收，重复2次，即在24 h内提取4次。集4次提取液于烧杯中，将提取液经蒸发将近干后，用硝酸-高氯酸(4:1)加热消化至溶液透明清亮，放置过夜后加热，直至烧杯中溶液将近干。冷却至室温，用去离子水定容至50 ml。将上次提取残渣用下一提取剂按以上方法继续提取，并最终定容至50 ml。用optima 4300DV型全谱直读等离子体发射光谱仪测定溶液中铝含量，工作条件如表 2。

1.2.4 数据处理与分析

采用EXCEL和SPSS13.0软件对微核率、核仁数、铝不同化学态含量等的平均值与对照之间进行t检验，并对试验所取得的所有数据采用平均值±SD值绘图。

2 结果与分析 2.1 胁迫条件下马尾松幼苗根尖细胞的微核率变化

当环境因素对生物的遗传物质具有遗传毒性时，会导致遗传损伤，产生微核。微核率可作为评价各种物质遗传毒性的标准(王映雪，2000)。在酸雨、铝或者酸雨-铝的不同胁迫处理下，马尾松幼苗根尖细胞均会呈现出遗传损伤现象，产生染色体断裂(图 1)，后期桥(图 2)和落后染色体(图 3)，进而染色体断片和落后染色体形成细胞微核(4)。

在单一酸雨胁迫下，虽然随着pH值的下降，马尾松幼苗根尖细胞的微核率呈现出逐渐增大的趋势，在pH值为5.6时，t检验的结果表明马尾松的微核率与对照相比没有达到显著差异水平，而在pH4.5~3.5范围内，马尾松的微核率变化达到显著或极显著差异水平(图 5)。

在单一铝或者酸雨-铝交互胁迫下，随着pH的下降或铝浓度的上升，细胞的微核率急剧上升(图 5，6)，与对照进行t检验的结果表明不同处理均达到显著或极显著差异水平。但是，在酸雨-铝处理下，当pH < 3.5时，微核率从最高值开始逐渐下降。单一的铝处理，则在铝浓度大于3 000 mg·L^-1时，微核率从最高值开始下降。表明当胁迫条件超过马尾松幼苗的最大耐受力时，由于遗传物质的严重损伤，进而抑制马尾松细胞的正常分裂，结果出现微核率下降的趋势，这在其苗高和根系生长抑制指数试验中也反映出这种趋势。在1 000 mg·L^-1的铝浓度的胁迫下，马尾松微核率为6.1%，而当pH3.5+1 000 mg ·L^-1铝浓度时，产生的微核率为43.9%，后者是前者的7.2倍，甚至还高于3 0 00 mg·L^-1铝浓度导致的微核率38.4%。这些现象表明酸雨的存在会加重铝对马尾松幼苗的染色体损伤。

2.2 胁迫条件下马尾松幼苗根尖细胞的Ag-NORs变化

核仁的主要功能是参与rRNA的合成、加工和核糖体亚基的装配与运送到细胞质。在NOR区，有转录活性或转录后其上仍残留与rRNA相联系的蛋白质的核仁才能被硝酸银染色。所以Ag- NORs数量的减少，反映了有转录活性的rRNA数量下降。马尾松幼苗根尖正常细胞的Ag-NORs平均数为7，而且Ag-NORs比较大(图 7)。在酸雨、铝或者酸雨-铝的不同胁迫处理下，其细胞Ag-NORs数目会逐渐减少(图 8)，从图 10~11可以看出，酸雨虽然会导致马尾松幼苗根尖细胞Ag-NORs数目下降，但是与对照相比t检验的结果均未达到显著差异水平。酸雨-铝的交互胁迫作用在pH5.6时，对Ag-NORs数目的影响不显著，但是，当pH < 5.6时，随着pH的逐渐下降，对Ag-NORs数目的影响逐渐加大，t检验的结果表现出显著或极显著差异。单一的铝处理对Ag-NORs的影响经t检验均达到显著或极显著差异水平。当铝浓度为3000 mg·L^-1时，Ag-NORs数目下降到最低，但是当铝浓度为5 000 mg·L^-1时，Ag-NORs数目却又出现上升趋势，不过此时Ag-NORs变小(图 9)，表明对细胞伤害严重，部分的核仁转录活性下降，大核仁破碎成小核仁，导致数目不降反增。

2.3 胁迫条件下马尾松生理生化指标的变化 2.3.1 MDA含量的变化

MDA是脂膜过氧化产物之一，反映了脂质过氧化强度和膜系统伤害程度(李合生等，2001)。不同的胁迫条件下，马尾松幼苗的MDA含量变化见图 12，可以看出随着铝浓度的增加，马尾松幼苗体内MDA的积累量不断增多。在酸雨-铝的胁迫下，随着pH值的下降，MDA含量逐渐增加，表明马尾松的膜系统伤害在逐渐加重。

2.3.2 质膜透性的变导率的变化

反映了胁迫因子对植物细胞质膜伤害的情况，当细胞质膜受到破坏，膜透性加大，选择通透性丧失，会导致细胞内电解质渗漏。从图 13可以看出：随着铝浓度的增加，质膜伤害度逐渐缓慢加大，当铝浓度>2 000 mg·L^-1时，随着铝浓度的增加，对膜伤害度急剧加大。

在酸雨_铝的交互作用下，随着pH的降低，铝浓度的上升对马尾松叶片质膜伤害度明显增强。尤其是当pH为2.5，铝浓度为100~1 000 mg·L^-1时，叶片质膜伤害度表现出急剧上升状态，而当铝浓度在1 000~3 000 mg·L^-1时，叶片质膜的伤害度变化反而趋向稳定，变化范围仅为0.01~0.022，其原因可能是当酸雨-铝交互作用对细胞质膜的伤害达到一定程度时，导致质膜的选择性通透屏障被严重破坏，膜体系崩溃，反而出现电导率趋向稳定。说明强酸加重了铝对质膜系统的伤害。

2.3.3 SOD和POD的变化

SOD和POD是植物体内重要的抗氧化酶，在保护植物体免受活性氧伤害，维持活性氧代谢平衡上处于重要的地位。对胁迫状态下马尾松幼苗的SOD和POD活性的测定结果如图 14，15，从图中可以看出随着铝浓度的升高，马尾松幼苗的SOD活性和POD含量逐渐升高，当铝浓度到达2 000 mg·L^-1时，SOD活性到达最高。但是，当铝浓度超过2000mg·L^-1时，SOD活性急剧下降。

此外，随着pH的降低，SOD活性呈现下降趋势，但是pH 4.5与pH 5.6的SOD活性变化趋势比较一致。pH3.5与pH2.5的SOD活性影响的变化趋势较相似。比较前者与后者的变化趋势，后者具有较大的下降变化，表明在强酸状态下，马尾松的SOD受到抑制，自我防护能力下降。

pH对POD活性的影响也呈现出3.5≤pH和pH>3.5 2种不同的变化趋势，在前者的变化趋势中，铝浓度到达1 000 mg·L^-1时，POD活性达到最高，而后随着铝浓度的加大POD活性开始急剧下降。在后者的变化趋势中，铝浓度到达2 000 mg·L^-1时，POD活性才开始下降。其原因可能是强酸加重铝对POD合成功能的抑制和破坏，当这种抑制和破坏超过了马尾松的耐受力，就会使得POD活性不升反降。

2.4 胁迫条件下马尾松体内铝含量与化学态分析 2.4.1 单一铝胁迫下马尾松体内铝含量与化学态分析

胁迫状态下马尾松体内铝的含量和化学态对于研究马尾松对铝的抗性机制具有较大的意义。对马尾松幼苗不同部位的铝含量与化学态研究的结果见图 16，可以看出：在铝胁迫下，马尾松幼苗的叶与根茎的各种不同化学态的铝大量增加，与对照相比t检验结果均达到极显著水平。其中根茎铝的醋酸氨提取态(FNH₄Ac)和氯化钠提取态(FNaCl)含量略高于叶片，但是残余态铝(FR)在根茎中的含量大大高于叶中。此外，根茎中游离态的铝占总铝的42.8%，叶片中游离态的铝占总铝的47.8%，两者差别不是很大。这些现象表明游离态的铝在马尾松体内易于转移，不同部位差别不大，而非游离态的铝移动受限，所以在根茎部蓄积量远大于叶片的蓄积量。

2.4.2 不同酸雨与铝交互胁迫作用对马尾松幼苗体内总铝含量的影响

不同酸雨与铝交互胁迫作用对马尾松幼苗体内总铝含量的影响结果根茎中铝蓄积量远高于叶中铝蓄积量(图 17)。与对照相比t检验结果为：不同pH值的酸雨对铝在马尾松体内的蓄积影响均达到极显著水平。在pH值5.6~3.5的范围内，随着pH值的下降，马尾松体内铝的蓄积量不断上升，当pH值达到3.5时，叶与根茎中铝蓄积量达到最高值，表明酸雨会促进铝对马尾松的胁迫作用，从而加剧铝在马尾松体内的蓄积。但是当pH < 3.5时，则出现随着pH值的下降，铝的蓄积量下降的趋势。其原因可能是强酸引起细胞壁与膜系统的严重破坏，出现细胞电解质大量外渗。因此，反而出现马尾松幼苗体内铝含量下降的趋势。

3 讨论 3.1 不同胁迫条件对马尾松幼苗根尖细胞的损伤机理

本研究结果表明：在马尾松的耐受范围内，随着胁迫的加重，马尾松幼苗体内的游离态铝含量急剧上升，由于游离态铝在马尾松体内可以自由转移，所以表现出根茎与叶片的游离态铝总含量差异不大。酸雨与铝毒害的结果使得马尾松根尖呈现细胞微核率上升，核仁平均数下降，MDA含量上升，叶片细胞伤害度上升的现象，说明不同的胁迫条件对马尾松造成了不同方面的损伤，其对马尾松的损伤程度为：酸雨-铝>单一铝>单一酸雨。

酸雨、铝对马尾松的遗传损伤机理：本试验的结果表明马尾松微核来源于染色体断片和落后染色体。酸雨-铝胁迫对马尾松细胞的遗传损伤和生理生化指标影响比单一铝或单一酸雨胁迫的影响大，是因为酸雨破坏了马尾松细胞形态结构，使酸性物质通过扩散进入细胞，进而溶解破坏膜系统等，也使得Al³⁺更容易进入细胞内。由于Al³⁺有较强的电荷可以诱导植物体内产生大量的·0₂，H₂O₂，·OH等活性氧自由基(Guo et al., 2004; Yang et al., 2005)，这些活性自由基会对糖残基进行攻击，引起DNA的碎裂、碱基丢失和有末端糖残基片段的链断裂，导致产生染色体断片，丢失末端的染色体由于失去端粒的保护，很容易出现断端重接，形成双着丝粒染色体，在后期出现后期桥现象。此外，Al³⁺会抑制植物对Mg²⁺和Ca²⁺的吸收(Marschner, 1995)，而CaM只有与Ca²⁺结合形成复合物才具有生物活性。铝胁迫造成细胞内缺Ca²⁺，则会抑制CaM活化的PDE和Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase(徐友涵，1986)。由此必然影响和破坏Ca -CaM的生理活动和调节作用。Means等(1980)在以免疫荧光法研究分裂细胞内CaM的分布时，观察到Ca-CaM参与了细胞分裂中纺锤丝微管蛋白的组装和去组装过程，以及调控染色体的运动。CaM不能激活，纺锤丝微管蛋白的组装和拆卸必然受阻，因此，导致产生落后染色体和影响细胞周期。此外，酸雨和铝对马尾松的遗传损伤，还表现为干扰DNA的复制与转录，导致细胞的Ag-NORs数目发生下降趋势。而且当这种损伤超过马尾松的耐受极限时，会使得Ag- NORs破碎为小核仁，Ag-NORs数目出现不降反升趋势，但是观察到的Ag-NORs变小。与此同时，细胞周期延长，细胞分裂速率下降，进而出现微核率达到最高时，随着胁迫的进一步加重，微核率不升反降的现象。

本试验结果表明:在酸雨、铝的胁迫下，会导致马尾松膜系统受损时，表现出MDA含量上升，细胞内的电解质外渗增加，叶片细胞的电导率增大，伤害度上升的趋势。其原因是细胞壁带负电荷，外源阳离子能通过离子交换的形式结合到细胞壁上，细胞壁阳离子交换能力(CEC)越强，Al³⁺结合到壁上越多，毒害就会越大(Matsumoto，2000)。另外，果胶是初生细胞壁的主要成分，也是Al³⁺结合到细胞壁的主要位点(Willats et al., 2000)。此外，在Al³⁺胁迫下，会使马尾松体内产生大量活性氧自由基，这些活性氧自由基会启动细胞的膜脂过氧化作用，使马尾松细胞膜系统受到伤害。而丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化的产物，所以会产生上述现象。

在酸雨-铝的交互胁迫下，酸雨会促使土壤中不同化学态铝向高活性形态转化，随酸雨酸性的加强，活性铝的形态产生Al(OH)₂+→Al(OH) →Al³⁺的递变规律，使得Al³⁺ 含量速增，所以酸雨-铝的交互胁迫会加重铝对植物的毒害作用。本实验直接采用了模拟酸雨-Al³⁺的交互胁迫处理，虽然不存在铝离子的上述转变过程，但仍然表现出马尾松遗传损伤指标、细胞壁与膜系统损伤指标的变化呈现：酸雨-铝交互胁迫>单一铝胁迫>单一酸雨的现象。其原因可能是酸雨对细胞壁的酸解，破坏了细胞物质交换的通道屏障，并加重细胞壁带负电荷的状态，结果使得在酸雨-Al³⁺的交互胁迫下，毒害作用和细胞的各种损伤现象比单一的酸雨或单一Al³⁺胁迫更加严重。

3.2 马尾松对不同胁迫条件的抗性机制

在胁迫条件导致马尾松细胞各种损伤的同时也激发了马尾松不同抗性机制，以便进行自我保护。其机制之一：表现出在马尾松的耐受极限范围内，随着胁迫的加重，马尾松体内·O₂等自由基水平的升高导致SoxR蛋白的构型改变，并转而激活soxS基因的转录。SoxS蛋白则促进超氧化物歧化酶基因(soda)的表达，使得马尾松体内超氧化物歧化酶(SOD)活性增大，用以清除体内过多的·O₂自由基，其作用机理是将·O^2-歧化为H₂O₂，从而抑制膜脂过氧化产物丙二醛的积累，保持和修复细胞膜。而过氧化物酶(POD)则可把SOD等产生的H₂O₂变成H₂O，使活性氧维持在较低水平上。因此，随着胁迫的加重，POD含量也相应增加。但是，当马尾松体中的·O₂，H₂O₂等活性氧自由基水平的增加超过了马尾松的耐受极限，则会导致组织细胞多种功能膜及酶系统破坏，进而出现SOD活性和POD的含量增加到极限时开始下降的现象。机制之二：在铝胁迫下马尾松幼苗的根茎部和叶片内，F_R>F_NH4Ac>F_NaCl，以非游离态铝的含量占优势，而且随着铝胁迫的加重，非游离态铝含量也急剧上升。表明马尾松体内会产生一些物质与铝相结合形成活性较低的难溶性化合铝。这样可减少游离铝的含量，使其有效性和移动性降低，从而降低其对马尾松的伤害。另外，马尾松根茎铝的蓄积量大于叶片，也表明有一部分铝是以难溶的形态存在，所以它不容易由根部向地上部分迁移，导致根茎部蓄积大量铝元素，在一定程度上降低了对马尾松叶绿体、线粒体和核膜等重要细胞器的损伤。

在酸雨-铝的交互胁迫下，随着酸度的加强，马尾松体内的铝蓄积量急剧上升，在pH为3.5时，马尾松根茎的铝蓄积量达到最高极限为1 369.1 mg·kg^-1，但是当pH降到2.5时，马尾松体内的铝蓄积量反而出现下降现象，说明马尾松在pH5.6~3.5之间具有较强的铝蓄积能力和耐铝性，然而，pH值低于3.5对马尾松将会产生严重的伤害。

4 结论

1) 当pH值为5.6~3.5或铝浓度为100~3000 mg·L^-1时，随着pH值的下降或铝浓度的上升，马尾松幼苗的微核率逐渐上升，表明其染色体损伤在不断加重。当pH值和铝浓度超过上述范围时，马尾松微核率不升反降，表明损伤已经进一步影响到细胞的分裂速度。不同胁迫对马尾松微核率的影响程度为酸雨-铝>铝>酸雨。

2) 在pH值为5.6~2.5或铝浓度为100~3 000 mg·L^-1时，随着pH值的下降或铝浓度的上升，马尾松核仁平均数逐渐下降。表明核仁转录活性下降。不同胁迫对马尾松微核率的影响程度为铝>酸雨-铝>酸雨。

3) 当铝浓度为100~3000 mg·L^-1或pH值为5.6~2.5时，随着铝浓度的逐渐加大或pH值的不断下降，马尾松幼苗体内的MDA含量和叶片质膜伤害度不断上升，与此同时也激发其体内抗氧化酶SOD活性和POD含量逐渐上升，但是当胁迫状况超过马尾松的自身耐受程度时，SOD活性和POD含量反而开始下降。

4) 在酸雨-铝的交互胁迫下，马尾松在pH值5.6~3.5之间具有较强的铝蓄积能力和耐铝性。低于3.5的pH值对马尾松将会产生严重的伤害。

5) 马尾松的抗铝机制：通过提高SOD和POD的合成，来降低铝的毒害与损伤；通过产生一些物质与铝相结合形成活性较低的难溶性化合铝，使其活性和移动性降低，蓄积在根茎部，以降低其毒害作用。