木醋液是从木材、木材加工废弃物或森林抚育采伐所产生的枝桠等炭材干馏得到的冷凝物，经澄清分离出沉淀木焦油后所形成的红褐色液体。随着制炭工业的发展，除木材以外的植物(如竹材、玉米核、松塔、棕榈核、核桃壳、杏核壳和椰壳等)也可以通过干馏得到与木醋液性质相似的液体。由于原料资源丰富、生物量大，木醋液中又含有种类和数量可观的有机物质，其中还有许多具有生物活性，因而具有很大的开发利用前景(史咏竹等，2003)。有学者曾对一些原料制备木醋液的利用进行过研究，但大多使用的木醋液为木材干馏过程中全程温度段所形成的产物，对分温度段收集木醋液进行研究，报道甚少(Loo et al.，2007; Yatagai et al., 2002; Yoshimura et al.，1995; Ohta et al., 1994; 张全国等，2006)。

苹果(Malus)是中国第一大水果品种，栽培面积近189万hm²。中国苹果栽培面积占世界的40%(翟衡等，2007)。陕西省是中国苹果主产区之一，2005年栽培面积已达到42.63万hm²，2008年陕西省苹果栽培面积为53.33万hm²(佟海恩等，20 04)，而每年由于苹果树修剪而产生约200多万吨的苹果树废枝杆以及因品种更新砍伐所产生的苹果树木材长期得不到有效利用，造成巨大的资源浪费和环境污染。为了使这一资源得到充分利用，本文以苹果枝为原料，采用干馏法制取、分不同温度段收集苹果枝木醋液，对各温度段木醋液的化学成分以及抑菌、抗氧化活性间的差异进行研究，以期为进一步开发天然杀菌、防腐剂和抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料与仪器

苹果枝取自陕西渭北当年修剪的树枝，经自然干燥后备用; 乙醚、DPPH·(1, 1-二苯基-2-苦基苯肼自由基)，TPTZ(Fe³⁺-三吡啶三吖嗪)，BHT(2, 6-二叔丁基对甲酚)、抗坏血酸、硫酸亚铁、三氯化铁等均为分析纯; 木炭粉(市售); 各种微生物由西北农林科技大学微生物实验室提供; 干馏釜由南京林业大学化工学院制造(内径×高: 130 mm×27 0 mm); 气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪(美国Finnigan公司，型号: TRACEGC -TRACEDSQ)。

1.2 试验方法 1.2.1 苹果枝木醋液的制取及精制

参照文献(尉芹等，2008)。将直径约为5 cm的干燥苹果枝切成10 cm的圆柱条，放入干馏釜中加热，按3个温度段收集:低温度段(100~200 ℃，AP₁)，中间温度段(200~310 ℃，AP₂)，高温度段(310~500 ℃，AP₃)，并进行精制处理，得精制木醋液，用作抑菌活性试验。

1.2.2 苹果枝木醋液的脱水处理

取各温度段精制木醋液100 g，每次用3 0 mL乙醚萃取6次，合并乙醚萃取液，经干燥，浓缩回收乙醚，得脱水木醋液: 5.62 g(100 ~200 ℃温度段), 17.22 g(200~310 ℃温度段), 17.50 g(310~500 ℃温度段)。用作抗氧化活性试验和GC-MS化学组成分析(徐社阳等，2006)。

1.2.3 抑菌试验

测定由1.2.1制取的木醋液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌(Bacterium proteus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和产气杆菌(Aerobacter aerogenes)等细菌的抑制作用(程丽娟等，2000)。抑制效果以抑菌圈直径大小(mm)表示，即抑菌圈直径＝测量直径_6。

测定木醋液对黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉(Pseudomonas sp.)、绿木霉(Trichoderma virens)和康氏木霉(Trichoderma koningii)等霉菌的抑制作用(周德庆，1994)。抑制效果以抑菌圈直径大小(方法同上)。

测定木醋液对小麦根腐病原菌(Cochliobolus sativus)、棉花黄萎病原菌(Verticillium dahliae)、葡萄炭疽病原菌(Gloeosporium fructigenum)、番茄晚疫病病原菌(Phytophthora infestans)、葡萄灰霉病原菌(Botrytis cinerea)等植物病原菌的抑制作用。将AP₁，AP₂，AP₃用无菌水进行倍半稀释后配制成40，20，10，5，2.5，1.25，0. 625 mg·mL^-1等系列浓度的木醋液，并以无菌水为对照进行毒力测定(慕立义，1994)。所得数据经Finney机率值分析法用DPS统计软件求出毒力回归方程、EC₅₀值和相关系数r。对各种植物病原菌的抑制效果以EC₅₀表示。

1.2.4 抗氧化试验

1) 清除DPPH·自由基能力测定参照文献(Vattem et al., 2004;牛鹏飞等，2008)的方法进行。在2.0 mL 60 μmol·L ^-1 DPPH·无水乙醇溶液中分别加入3 mL不同浓度的脱水木醋液、BHT和抗坏血酸，用力摇匀后于室温下放置30 min，测定其在517 nm下的吸光值(A_s); 以3 mL水代替样品为空白对照(A₀); 以3 mL样品与2mL无水乙醇混合液为样品对照(A_x)，以消除样品本身颜色的影响; 以3 mL水和2 mL无水乙醇的混合液调仪器零点。每个样品每个浓度重复3次，取平均值。清除率按下式计算:

DPPH·清除率(%)=[A₀－(A_s－A_x)]/A₀×100%。

2) FRAP法测定木醋液的还原力参照文献(牛鹏飞等，2008)的方法进行。取不同浓度脱水木醋液各2 mL，加入3 mL TPTZ工作液，混合后于37 ℃反应，30 min后，于593 nm处测定吸光度值和还原力标准曲线，计算FeSO₄浓度，以FeSO₄浓度(mg·L^-1)表示木醋液的还原力大小。TPTZ工作液的配制参见文献(Benzie et al., 1996)。还原力标准曲线的制作参照文献(牛鹏飞等，2008)。

1.2.5 GC-MS测定方法

将脱水木醋液用乙醚稀释后, 直接进行GC-MS分析。气相色谱条件: DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度220 ℃，柱温60 ℃，恒温2 min后，以6.0 ℃·min^-1速度升温至240 ℃，恒温8 min。分流进样80:1。载气流速1.0 mL·min^-1。质谱条件: EI源，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，质量扫描范围35~400 amu。质谱标准库: NIST库。

2 结果与分析 2.1 不同温度段苹果枝木醋液抑菌试验效果 2.1.1 对细菌抑制效果

将AP₁，AP₂，AP₃分别进行对几种细菌的抑菌试验，并做方差分析。结果见表 1。3种木醋液对供试细菌均有一定的抑制作用，且AP₂＞AP₃＞AP₁，除枯草杆菌外，AP₂对供试的金黄葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、产气杆菌的抑制作用均与AP₁和AP₃间存在显著差异; AP₃对金黄葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用也在较高水平，说明中间温度段和高温度段的苹果枝木醋液具有较强的抑制细菌的作用。

2.1.2 对霉菌抑制效果

对霉菌的抑制效果及方差分析结果如表 2所示。AP₁、AP₂和AP₃对霉菌均有一定的抑制作用，除AP₃对绿木霉菌的抑制效果大于AP₂外，3种木醋液对供试菌的抑制活性的大小顺序为AP₂＞AP₃＞AP₁。其中A P₂的抑菌作用最强，且AP₂与AP₃和AP₁间均存在显著差异。

2.1.3 对植物病原菌抑制效果

为了定量比较AP₁，AP₂，AP₃对植物病原菌抑制活性间的差异，将AP₁，AP₂，AP₃分别进行倍半稀释配制成一系列浓度，进行毒力测定。得到有效中浓度EC₅₀，以EC₅₀作为衡量苹果枝木醋液对植物病原菌抑制活性大小的指标，结果如表 3。EC₅₀的大小顺序为AP₁＞AP₃＞AP ₂，即3种木醋液对供试植物病原菌的抑制活性大小顺序为AP₂＞AP₃＞AP₁，AP₂的EC₅₀值均小于AP₁和AP₃的EC₅₀值，AP₁对供试的5种植物病原菌的EC₅₀分别是AP₂的8.95，8.05，12.74，7.52和13.85倍，AP₃是AP₂的1.6 8，1.29，2.25，1.41和2.05倍，证实AP₂具有最强的抑制植物病原菌的活性。

2.2 不同温度段苹果枝木醋液抗氧化试验效果 2.2.1 清除DPPH·自由基活性

二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)是1种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能够清除它，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或者过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应等抗氧化作用。由图 1可知：不同温度段苹果枝木醋液对DPPH·均有一定的清除作用，且呈显著的量效关系，其清除能力顺序为AP₁＞AP₃＞AP₂＞抗坏血酸＞BHT，在试验浓度范围内，抗坏血酸和BHT对D PPH·清除能力均比3种木醋液低。

2.2.2 木醋液的还原力

一般情况下，物质的还原力越强，其抗氧化活性越高，通过FRAP法测定木醋液的还原力，可评价其抗氧化活性的大小。

采用1.2.4中2)方法进行试验，由吸光度对FeSO₄(mmol·L^-1)进行回归后，得标准曲线方程为Y=6.847c+0.060 3，式中Y表示吸光度，c表示FeSO₄的浓度，相关系数R²=0.999 7。取不同浓度的3种木醋液进行还原力测定，结果如图 2。

由图 2可以知:随着木醋液浓度的增加，FeSO₄浓度也在不断增加，说明木醋液的还原力不断增加，其浓度与还原力呈正相关; 3种木醋液还原力大小不同，呈现AP₁＞AP₃＞AP ₂的顺序，且均大于BHT，AP₁在试验浓度范围内均大于抗坏血酸(ascorbotic acid)，A P₁表现出最强的还原力。图 1，2说明苹果枝木醋液在较低的浓度下(0.002~0.018 mg·mL^-1)具有较强的抗氧化效果。

2.3 苹果枝木醋液GC-MS分析结果

按1.2.5所述条件对3种木醋液的有机成分进行GC-MS分析，采用NIST标准质谱库检索和人工解析相结合的方法对各化合物(匹配度>90%)进行鉴定，并采用峰面积归一化法测定各成分的相对百分含量, 分析结果如表 4。

在高温下，木材中的碳水化合物和木质素类物质发生热解反应，生成各种化学物质。其中，碳水化合物发生热降解反应，生成酮类、醇类以及呋喃和吡喃衍生物; 木质素则在高温下裂解产生酚、愈创木酚、丁香酚、邻苯二酚以及它们的衍生物。AP₁中共检出45种物质，占整个出峰面积的91.26%，有机成分含量最多的是酚类化合物，含量为51.33%，其中苯酚在这一温度段木醋液中含量较高，为14.59%，其次是有机酸，含量为18.5%，其中乙酸含量为16.28%，酮类含量为8.98%，呋喃衍生物含量为7.23%; AP₂中共检出47种物质，占整个出峰面积的95.35%，含量最多的是有机酸，为40.05%，其中乙酸含量为32.92%，其次是酚类含量为24.69%，其他物质含量分别是:酮类为7.52%，呋喃衍生物为12.81%; AP₃中检出47种物质，占整个出峰面积的93.00%，其中酚类、有机酸、酮类和呋喃类含量依次为34.66%，28.37%，12.49%，6.93%。另外在各温度段木醋液中还含有少量的醇、酯和醚等。酚类和有机酸是苹果枝木醋液的主要成分。

有机酸在中间温度段木醋液中含量最多，达到40.56%，且乙酸含量高达32.92%，是抑菌作用的主要物质，此结果与文献报道有机酸具有抗菌、杀菌等功效的结论一致(Shui et al., 2002)。酚类在低温度段木醋液中含量最多，达到51.33%，是此温度段显示最强抗氧化作用的主要物质，这与文献报道的多酚是一类作用较强的天然抗氧化物质的结论一致(Lu et al., 2000; 冯伟，2001)。

3 结论

1) 采用干馏法分段收集制取的3种温度段苹果枝木醋液(100~200 ℃，AP₁; 200~310 ℃，AP₂; 310~500 ℃，AP₃)对供试的细菌、霉菌和植物病原菌均有一定的抑菌活性，但活性大小不同，其顺序为AP₂＞AP₃＞AP₁; AP₂的抑菌活性最强，且与AP₁和A P₃的差异显著，其中对植物病原菌的EC₅₀为2.43~5.27 mg·mL^-1。

2) DPPH法和FRAP法对3种温度段脱水水木醋液的抗氧化活性研究结果表明其抗氧化活性顺序为AP₁＞AP₃＞AP₂，且存在显著的量效关系，低温度段的苹果枝木醋液的抗氧化活性最强，且均高于抗坏血酸和BHT。

3) GC-MS分析结果表明：苹果枝木醋液是1种组成相当复杂的混合物，不同温度段木醋液的有机成分的种类相似，而含量差别较大，AP₁中共检出45种物质，其中含量最多的是酚类，高达51.33%，AP₂中共检出47种物质，其中含量最多的是有机酸，为40.05%，AP₃中检出47种物质，酚类和有机酸含量介于AP₁和AP₂之间。在各温度段木醋液中除了含量较多的酚类、有机酸、呋喃衍生物、酮类之外，还含有少量的醇、酯和醚等。中间温度段木醋液较强的抑菌活性与其中有机酸含量较高有关，低温度段较强的抗氧化活性与其中酚类含量较高有关。

4) 苹果枝木醋液作为天然抑菌剂，防腐剂和抗氧化剂，在环保、食品、医药等方面具有进一步开发利用的价值。