蜀柏毒蛾(Parocneria orienta)属鳞翅目、毒蛾科、柏毒蛾属。主要危害柏木(Cupressus funebris)、侧柏(Platycladus orientalis)等柏科树种，是四川省第一大森林食叶害虫，每年发生危害面积66万hm^{2 1)}。2007年在林间蜀柏毒蛾暴发种群中发现大量虫体萎缩、体色变红。经采集、分离得到一株病原菌，初步鉴定属无芽胞杆菌类的假单胞菌属(Pseudomonas)。目前，利用芽孢杆菌属(Bacillus)细菌防治害虫已研究得比较深入，而且已大量登记产品并进行产业化生产，但无芽胞杆菌昆虫病原研究很少(戴冠群等，1991)。假单胞菌属于无芽胞杆菌类，能产生多种抗生素、改善植物营、促进植物生长，部分假单胞菌株具有杀虫功能。国内外除铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、类产碱假单胞菌(P. pseudoalcaligene)、洋葱假单胞菌(P. cepacia)、嗜麦芽假单胞(P. maltophia)和食酸假单胞菌(P. acidovorans)在昆虫中分离到(Lysenko, 1985)，特别是类产碱假单胞菌对草地蝗虫、草地草原毛虫致病性有较为深入的研究外(刘世贵等，1993；1995；张文等，1997；1998；金虹等，2005；赵建等，1999；2004；杨志荣等，1999)，没有发现其他有关假单胞菌对蜀柏毒蛾致病性的研究报道。本文对从林间蜀柏毒蛾暴发种群的虫体中采集分离的这株无芽胞杆菌病原进行了鉴定、室内毒力测定及林间防治效果研究。

1) 陈起忠.1980.四川省森林蓄积生长量的初步预测与永续利用问题.四川省林业勘察设计院.

1 材料与方法 1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(由四川农业大学植保系实验室提供)、2龄蜀柏毒蛾幼虫(林间采集，在室内饲养5天，选择生长整齐健康的虫体)、肉汁胨培养基NA (牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、琼胶20 g、水1 L)、一步式广谱DNAout试剂盒(由天泽生物工程有限公司生产)、PCR纯化试剂盒(由上海碧云天生物公司生产)。

1.2 试验方法 1.2.1 病原菌分离纯化

取自然发病生长不正常的蜀柏毒蛾幼虫1头，经过表面消毒和灭菌水洗过3次后，用灭菌的镊子将虫体研碎静置10 min，然后用涂布法和画线法分别接种到事先准备好的肉汁胨培养基中, 将培养基翻转, 放在35 ℃的恒温培养箱中培养。待菌落长出后，挑单个菌落进行镜检，选择形态与病死虫体内病原菌相同的菌落进行摇瓶，再将摇瓶液稀释后接种到NA培养基上，得到纯的病原细菌。

1.2.2 病原菌再接种试验

将第1次室内接种试验发病死亡的幼虫分离纯化, 然后将纯化后的病原菌再接种蜀柏毒蛾2龄幼虫, 最后将发病死亡幼虫分别镜检、分离纯化, 并将纯化后的病原菌与第1次分离纯化后的病原菌做生理生化特性对比。

1.2.3 病原菌形态观察与生理生化试验

主要方法参照《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物实验手册》 (东秀珠等，2001；周德庆，1983)。

1.2.4 16S rDNA的PCR扩增与扩增序列的同源性分析

将分离到的纯菌株35 ℃画线培养36 h后，按照一步式广谱DNAout试剂盒中使用说明提取DNA，选用16S rDNA通用引物：16(+)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC，492r(-)′5-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′。PCR反应体系(25μL)：模板DNA2μL、引物各1μL、PCR Mix12.5 μL，ddH₂O8.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃变性1min，45℃退火1.5min，72℃延伸2min，循环26次；72℃延伸10min。扩增产物用含有1.5μg·mL^-1 EB的缓冲液、1.0%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，电压60V，时间30min，凝胶成像系统记录结果。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

DNA序列同源性分析在NCBI(national centre for biotechnology information)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)采用Blast软件检索，将检索结果再用DNAMAN5.2软件的Multiple Sequence Alignment进行16S rDNA同源性分析，并构建系统发育树。参考序列取自Genbank, EMBL (European molecular biology laboratory), DDBJ(DNA data bank of Japan)等数据库(黄正等, 2004)。

1.2.5 病原菌毒力测定

将缺陷假单胞菌从平板上刮下配成悬浊液，用血球计数板测得含量后，分别稀释成2×10⁹，2×10⁸，2×10⁷，2×10⁶，2×10⁵ cfu·mL^-1 5种含量的菌液，然后将从林间采回的新鲜蜀柏嫩枝条用事先配好的5种含量菌液充分浸湿后凉干，将枝条分别插入塑料瓶中，每个塑料瓶中放入30头待测的2龄虫体。每种含量菌液设3个重复，温度25 ℃，恒温饲养3天后，更换无毒清洁柏叶，同时设立3个清水对照组，每天观察记录虫体死亡情况, 并收集虫粪，称量，第20天结束。最后将未死亡的幼虫一直饲养到化蛹、羽化、产卵。收集各组未死幼虫的化蛹数、羽化数、产卵量和孵化率。

1.2.6 林间防治效果试验

选择高度为2.5 m左右纯柏木幼林0.5 hm²。使用含量为2×10⁹cfu·mL^-1的病原菌对林间越冬代2~3龄蜀柏毒蛾幼虫进行喷雾防治，随机设立50株样株，同时设立50株清水喷雾处理对照，对照与处理之间间隔10m避免喷雾时相互影响。记载其虫口数，喷洒后第10，20天观察记载样株上的虫口数。

1.2.7 数据处理

将室内和林间试验各处理组虫体死亡率转化成校正死亡率，将各处理含量转化为含量对数值。计算各处理含量对数值与校正死亡率的回归方程、95%的置信区间并进行卡方检验，各处理含量对数值与累积粪便质量、平均体长、平均体质量、平均羽化率、平均怀卵量、卵孵化率的5%显著水平和1%极显著水平分析采用DPS软件的试验统计分析。室内测定病原菌对2龄蜀柏毒蛾幼虫毒力以LC₅₀表示。校正死亡率用Abbott校正死亡率公式计算：校正死亡率=(处理组死亡率－对照组死亡率)/(1－对照组死亡率)×100%。

2 结果与分析 2.1 病原菌的细胞形态和培养特征以及生理生化特征

病原菌呈杆状，菌体长1~3μm，宽0.5~1μm，在肉汁胨培养基上菌落呈圆形，光滑湿润，不透明，边缘整齐，表面隆起。对病原菌进行了12项生理生化测试，结果见表 1。

由表 1可知，该病原菌革兰氏染色和芽孢染色阴性，氧化酶和接触酶阳性，根据第8版《伯杰氏细菌鉴定手册》(伯杰氏，1984)，将该病原菌初步鉴定为假单胞菌(Brevundimonas)。

2.2 病原菌再接种试验

通过镜检观察表明，在再接种试验发病死亡的幼虫虫体中存在大量与第1次接种形态特征相似的细菌, 经分离纯化, 该病原菌与第1次接种病原菌在革兰氏染色、芽孢染色、接触酶试验、明胶水解试验等生理生化特性上完全一致，充分说明该细菌对蜀柏毒蛾具有致病性。

2.3 病原菌的系统发育分析

病原菌的16S rDNA序列测定结果表明，扩增的DNA序列全长1 469 bp，将Blast软件在NC BI网站上检索的结果再用DNAMAN5.2软件的Multiple Sequence Alignment进行16S rDNA同源性分析，够建系统发育树见图 1。

由图 1可知，病原菌株与Brevundimonas bullata(AB023428)的保守序列有100%同源性。因此确定该病原菌为缺陷假单胞菌(Brevundimonas bullata)。

2.4 病原菌室内毒力及林间防治效果

缺陷假单胞菌对蜀柏毒蛾2龄幼虫的毒力测定的LC₅₀及其95%置信限、毒力回归方程和虫体死亡时间和死亡率关系见表 2和图 2。

从图 2a可知，缺陷假单胞菌对蜀柏毒蛾2龄幼虫的作用时间较慢，而死亡高峰期一般为处理后的第5到第10天，15天后虫体基本不再死亡。

蜀柏毒蛾2龄幼虫经缺陷假单胞菌不同浓度菌液处理后, 平均每头幼虫取食曲线、粪便累积质量、化蛹前1周幼虫的平均体长和平均体质量以及化蛹后的羽化率、平均怀卵量、卵的孵化率与对照比较分析见图 2b和表 3。

从图 2b和表 3可知，蜀柏毒蛾2龄幼虫经缺陷假单胞菌处理后，对各个含量处理的幼虫都具有明显的抑食作用，各个含量处理幼虫在日均粪便质量和累积粪便质量上均显著少于清水对照。并且经缺陷假单胞菌处理后的未死幼虫在平均体长、平均体质量、羽化率、平均怀卵量和卵的孵化率方面都显著低于清水处理。

林间越冬代2~3龄蜀柏毒蛾幼虫进行喷雾防治第20天、50株处理样株的校正虫口下降率为43.5%，防治区未死残存幼虫在平均体长和平均体质量方面都明显低于对照组幼虫。

3 讨论

该株病原菌革兰氏阴性，细胞为杆状，无芽孢，氧化酶和接触酶均为阳性，16S rDNA序列测定结果用DNAMAN5.2软件的Multiple Sequence Alignment进行16S rDNA同源性分析证明与缺陷假单胞菌(AB023428)的保守序列有100%同源性。因此确定该病原菌为缺陷假单胞菌，又名缺陷短波单胞菌。在第8版《伯杰氏细菌鉴定手册》(伯杰氏，1984)中属于假单胞菌属，而在第9版《伯杰氏细菌鉴定手册》中从假单胞菌属中分到新属——短波单胞菌属。

在温度25 ℃下，蜀柏毒蛾2龄幼虫感染该株缺陷假单胞菌第20天，虫口下降率为53.33%，而同属的类产碱假单胞菌在感染草地蝗虫5d后，虫口下降率为92%(刘世贵等，1993)。类产碱假单胞菌对蝗虫具有毒杀作用的物质是其代谢分泌到胞外的一种杀虫蛋白质(张文等，1997；金虹等，2005；赵建等，2004)，而该菌株的杀虫物质和杀虫机理还有待进一步研究。

本研究结果表明，该株缺陷假单胞菌对蜀柏毒蛾2龄幼虫的毒力不是很强，但对蜀柏毒蛾幼虫取食具有明显的抑制作用，残存种群雌蛾产卵量和卵的孵化率等种群质量显著下降。缺陷假单胞菌在杀死部分幼虫后还残留了一定数量的低质量种群，这就为天敌昆虫提供食物来源，在一定程度上维持了天敌种群的稳定性，这对保护柏木林生物多样性具有意义。