植物自交不亲和性(self-incompatibility，SI)是植物为防止近亲繁殖，促进异花授粉而形成的一种机制，是研究植物细胞间信息传递、细胞间相互识别及基因时空表达的一种理想模型(De Nettancourt，2001)。荧光显微镜和花柱半离体培养是观察植物花粉管在花柱内生长状态的有效方法，在确定植物是否自交亲和试验中前者较后者更具有直观性，2种方法测定植物亲和指数与田间授粉方法相同(张绍铃等，2003b)。植物体内SOD，POD，CAT是膜保护系统的组成部分，能够在逆境胁迫中清除体内的有害物质维持体内的活性氧代谢平衡、保护膜结构、延迟或阻止细胞结构的破坏使组织保持活力(刘文革等，2003)，王保成等(2006)研究芸芥(Arabis hisuta)自交亲和性时表明SOD，POD和CAT 3种酶活性的变化与自交亲和系所具有的自交亲和基因的调控有关。植物激素和植物生长调节剂影响花粉萌发花粉管生长(张绍铃等，2003a)，但关于苹果自花授粉后花柱保护酶活性及内源激素含量与自交(不)亲和性关系的研究未见报道。本研究以苹果(Malus pumila)自交亲和品种早红香及自交不亲和品种斗南、富士和金冠为试验材料，研究自花授粉后花粉管生长情况及其与花柱保护酶活性和内源激素含量的关系，以期为揭示苹果自交亲和机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

河北省廊坊永清县前店村5年生自交亲和苹果品种早红香，笔者通过2007和2008年连续2年的授粉试验表明其自交授粉坐果率均达80%以上，产种率为9粒。河北省内丘县富岗山庄百花园6年生自交不亲和苹果品种富士、金冠和斗南。于开花前1周将预授粉的花序套玻璃纸袋，气球期去掉花序中心花，用事先准备好的花粉进行人工授粉(共包括5个授粉组合即：早红香、富士、金冠和斗南，金冠×富士)后套好纸袋。

1.2 试验方法

花粉萌发及花粉管生长的荧光显微镜观察：授粉后2，4，8，12，24，48，72 h分别采集1.1中5个授粉组合各25朵花的花柱用FAA(70%酒精:甲醛:冰醋酸=89:6:5)固定。将固定的花柱从基部切下复水后，用8 mol·L^-1的NaOH软化12 h，蒸馏水冲洗3次(共2 h)后放入事先配制好的过夜的脱色苯胺蓝溶液(0.1%苯胺蓝+0.1 mol·L^-1磷酸钾)中染色4 h，然后整体压片，在LEICADM4000B荧光显微镜下观察花粉管在花柱内生长情况并照相。

自花授粉后0，4，8，12，24，48，72 h分别采集1.1中4个自花授粉组合500个花序，采后立即将花柱分离称重(每个样品0.5 g，重复3次)并置于-70 ℃冰箱中保存，用于花柱SOD，POD，CAT，MDA，蛋白质及内源激素测定。花柱超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照NBT(氮蓝四唑)光化还原法(李合生等，2003)；花柱过氧化物酶(POD)活性测定参照愈创木酚法(李合生等，2003)；花柱过氧化氢酶(CAT)活性测定参照愈创木酚法(李合生等，2003)；花柱丙二醛(MDA)含量测定参照TBA(硫代巴比妥酸)法(邹琦，2001)。花柱蛋白质含量的测定采取Bradford法。花柱蛋白提取：将0.5 g花柱在液氮中研磨后加入5 ml提取液(50 mmol·L^-1 Tris-buffer PH8.0，300 mmol·L^-1 NaCl，10 mmol·L^-1 EDTA，10 mmol·L^-1 dithiothreitol-DDT，蛋白酶抑制剂(稀释成1:100))，提取混合物在冰上放置15 min后10 000 g离心10 min，收集上清即为花柱蛋白提取物。

花柱内源激素测定参照HPLC法(1992)。高效液相色谱仪为Agilent1100，液相色谱柱为Agilent TC-C18。激素标样IAA，GA₃，ZT和ABA为Sigma公司产品；除甲醇和乙腈为色谱纯外，其他所用试剂均为分析纯。色谱条件为：流动相(甲醇:水:冰醋酸=45:44.9:0.1)，柱温30 ℃，流速0.7 mL·min^-1，检测波长254 nm，进样量20 μL。

2 结果与分析 2.1 不同品种授粉后花粉萌发及花粉管生长状况

自交亲和性不同的苹果品种，自花授粉和异花授粉后不同时间花粉管在花柱内生长的荧光显微观察状况如图 1。大部分花粉粒在授粉后2 h萌发，但斗南苹果花粉直到自花授粉后12 h才开始萌发。授粉后4~8 h异花授粉(金冠×富士)、金冠自花授粉的花粉管生长长度均已达整个花柱的1/2，早红香和富士自花授粉花粉管生长长度为整个花柱的1/5。授粉后12~48 h异花授粉(金冠×富士)的花粉管穿过花柱1/2继续向下生长，早红香、斗南和富士自花授粉花粉管生长长度达整个花柱的1/2，金冠自花授粉花粉管在此时间段内没有生长。而授粉后48~72 h只有异花授粉组合(金冠×富士)和早红香自花授粉花粉管继续生长并穿过花柱基部，其他自交组合的花粉管在花柱内均停止生长。

2.2 自花授粉后花柱SOD活性的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱SOD活性的动态变化如图 2。3个自交不亲和的苹果品种自花授粉后0~24 h花柱SOD活性基本稳定，而此时花粉管在花柱内能正常生长。24 h以后变化剧烈，其中斗南、富士2个品种在自花授粉后24 h花柱SOD活性上升，而金冠苹果花柱SOD活性则急剧下降，并且该品种自花授粉后0~24 h其SOD活性均高于其他品种，该品种授粉后8 h花粉管长度达到整个花柱长度的1/2而且停止生长，可能是金冠苹果自花授粉后前期花粉管生长过快并且停止生长过早所致，这种不亲和反应激起体内SOD活性的升高。自交亲和的品种早红香自花授粉后0~48 h SOD活性缓慢降低，48~72 h SOD活性升高。

2.3 自花授粉后花柱POD活性的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱POD活性的动态变化如图 3。自花授粉后0~48 h自交亲和品种早红香的花柱POD活性无明显变化，且始终低于其他3个品种；48~72 h花柱POD活性快速上升，此时花粉管已通过花柱基部向子房生长，POD活性升高有利于清除体内有害物质从而顺利受精。自交不亲和品种富士在授粉后0~4 h花柱内POD活性开始上升，4 h达到最高值117.226 nmol·g^-1 FW，随后逐渐下降。斗南和金冠苹果在自花授粉后0~24 h POD活性较稳定，授粉后24 h POD活性达到顶峰随后开始下降，到48 h POD活性达最低值68.424 nmo·g^-1 FW，48~72 h变化不大，自花授粉后24 h自交不亲和苹果品种花粉管已停止生长，POD活性逐渐减弱表明花柱抵御有害物质侵入的机能开始减退。

2.4 自花授粉后花柱CAT活性的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱CAT活性的动态变化如图 4。自交亲和品种早红香自花受粉后0~48 h CAT活性基本保持稳定，且在4个苹果品种中处于最低值，48~72 h花柱CAT活性急剧上升，这与POD活性变化相似，保护酶活性的升高可能是花粉管得以继续生长的因素之一。自交不亲和的富士和斗南在自花授粉后4~48 h花柱CAT活性处于稳中有升的趋势，金冠在自花授粉后出现2次高峰，分别在授粉后4和24 h，这可能与金冠花粉管在自花授粉后开始加长生长最快有关，而金冠花粉管停止生长后即自花授粉后24~48 h CAT活性急剧下降。

2.5 自花授粉后不同时间MDA含量的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后不同时间MDA含量的动态变化如图 5。自交亲和品种早红香自花授粉后花柱MDA含量明显高于其他3个自交不亲和品种，并且在48 h内MDA含量渐次升高后降低。自交不亲和的3个苹果品种在自花授粉后0~24 h内花柱MDA含量变化较弱，这与花粉管在花柱内能正常生长的时间相一致。而24~72 h斗南和金冠花柱内MDA含量均出现上升趋势，24~48 h富士花柱内MDA含量均出现急剧下降而后又开始上升。早红香苹果MDA含量在自花授粉后48 h不但没有升高反而下降，而其他3个异花结实品种在自花授粉后48 h以后MDA含量均呈现上升趋势。

2.6 自花授粉后不同时间花柱蛋白质含量的动态变化

不同品种自花受粉后不同时间花柱蛋白质含量的动态变化如图 6。自花授粉后0~72 h 4个苹果品种花柱蛋白质含量均呈现双峰曲线变化，除自交亲和品种早红香花柱蛋白质含量变化幅度较大外，其他3个自交不亲和品种花柱蛋白质含量变化幅度很小；自花授粉后4 h4个苹果品种花柱蛋白质含量出现第1次高峰，自交亲和品种早红香花柱蛋白质含量最高，为5 745.348 μg·g^-1，此时各个苹果品种花粉已经大量萌发并开始伸长生长。自花授粉后24 h自交亲和品种早红香花柱蛋白质含量出现第2次高峰，并且自花授粉后0~72 h自交亲和的苹果品种花柱蛋白质含量均高于自交不亲和的苹果品种。

2.7 自花授粉后不同时间花柱GA₃含量的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱GA₃含量动态变化如图 7。自花授粉后0~4 h各苹果品种花柱GA₃含量均有所上升，4~24 h自交不亲和的3个苹果品种花柱GA₃含量变化不大，之后均缓慢下降；自交亲和的苹果品种早红香自花授粉后24 h花柱GA₃含量达到峰值为192 023.259 μg·g^-1，此时该苹果花粉管在花柱内正常生长，而自交不亲和的苹果品种花粉管已停止生长，表明高水平的GA₃对花粉管生长的促进。自花授粉后48 h花柱GA₃含量又下降到自花授粉后12 h的水平，直到72 h没有明显变化。

2.8 自花授粉后不同时间花柱ZT含量的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱ZT含量动态变化如图 8。自交不亲和的3个苹果品种自花授粉后不同时间花柱ZT含量变化趋势与GA₃含量变化趋势相似，但自交亲和的早红香苹果自花授粉后0~72 h变化趋势平缓，没有出现类似于GA₃含量变化的峰值。

2.9 自花授粉后不同时间花柱IAA含量的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱IAA含量动态变化如图 9。4个苹果品种花柱IAA含量均为刚授粉时最高，随后下降，自花授粉后4~24 h自交不亲和苹果花柱IAA含量变化较小，自花授粉后24~72 h花柱IAA含量开始缓慢下降，这可能与自交不亲和品种花粉管在花柱内停止生长有关；自交亲和品种早红香自花授粉后4~48 h花柱IAA含量变化不大，48~72 h花柱IAA含量有所上升。

2.10 自花授粉后不同时间花柱ABA含量的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱ABA含量动态变化如图 10。自交不亲和品种在自花授粉后0~4 h花柱ABA含量有所上升，但变化幅度不大，自花授粉后12~48 h花柱ABA含量开始大幅上升，自交不亲和品种ABA含量在自花授粉后出现2次高峰可能是抑制其自花花粉管生长的原因之一。自交亲和的早红香自花授粉后0~12 h花柱ABA含量有所上升但变化不大，之后又缓慢下降，72 h花柱ABA含量达到最低值。

2.11 自花授粉后不同时间花柱(IAA+GA₃)/ABA的动态变化与花粉管生长的关系

自花授粉后花柱(IAA+GA₃)/ABA动态变化如图 11。3个自交不亲和的苹果品种在自花授粉后0~12 h(IAA+GA₃)/ABA值处于上升趋势，12~24 h(IAA+GA₃)/ABA值急剧下降，之后(IAA+GA₃)/ABA值保持较低的平稳状态。自交亲和品种早红香在自花授粉后0~12(IAA+GA₃)/ABA值处于平稳状态，自花授粉后12~24 h(IAA+GA₃)/ABA值急剧上升，之后开始下降，但(IAA+GA₃)/ABA值高于其他品种。(IAA+GA₃)/ABA值出现的高峰均为自花授粉后花粉管正常生长的时间，因此认为较高的(IAA+GA₃)/ABA值有利于花粉管在花柱内正常生长。

3 讨论

苹果自花授粉后花粉在柱头开始萌发的时间不同，本研究中除斗南苹果为自花授粉后12 h花粉开始萌发外，其他品种自花授粉后2 h均能正常萌发，王浩等(2008)研究寒富苹果自花授粉表明花粉在授粉后8 h开始萌发，因此不同苹果品种自花授粉后花粉开始萌发的时间不同。陶书田等(2004)在研究果梅(Prunus mume)自花授粉表明不亲和的花粉管在花柱中部停止生长，陈迪新等(2004)研究砂梨(Pyrus pyrifolia)自花授粉表明不亲和花粉管在花柱1/3处停止生长，本研究表明苹不亲和的花粉长到花柱的1/2时停止生长，这与果梅不亲和花粉的花粉管停止生长部位相同，与砂梨花粉管停止生长部位不同。

齐国辉等(2005)研究表明：梨自交不亲和品种自花授粉后0~24 h花柱SOD，CAT活性呈现上升趋势，24 h以后呈现下降趋势。本研究自交亲和及不亲和苹果品种自花授粉后0~24 h SOD，POD，CAT活性和MDA含量均处于相对稳定的状态，花粉管能够正常生长；而自交不亲和品种自花授粉24 h后SOD，POD，CAT活性和MDA含量变化较大，花粉管停止生长。

自交亲和苹果品种早红香自花授粉后0~48 h花柱SOD，POD，CAT活性变化不大，说明花柱内活性氧的产生与清除系统处于动态平衡，有利于花粉管顺利通过花柱。授粉后48~72 h是花粉管穿过花柱进入子房的时间，此时花柱内SOD，POD，CAT活性均升高，MDA含量下降，而自交不亲和的苹果品种则花柱内SOD，POD，CAT活性变化甚微，MAD含量升高。SOD能催化O^2-歧化反应生成O₂和H₂O₂，而过多的H₂O₂对细胞有毒害作用，需要POD和CAT清除体内积累及SOD催化反应产生的过多H₂O₂，使花柱内H₂O₂处于较低水平，因此，自交亲和品种花粉管的正常生长需要各种保护酶之间的协同作用。

本试验中自花授粉后4~72 h自交亲和的苹果品种花柱蛋白质含量高于自交不亲和的苹果品种，其原因不明。Qiao等(2004)在研究金鱼草(Antirrhinum majus)自交授粉时得出，在不亲和授粉中S-RNase未被泛素化而降解花粉管中的RNA使花粉管停止生长，而亲和授粉则相反。本研究的苹果是不是因不亲和品种花柱S-RNase降解花粉管RNA，而亲和品种花柱S-RNase则对自身花粉管不起作用，这还有待进一步验证。

本研究自花授粉后花柱中GA₃含量升高与Jensen等(1977)在棉花胚珠离体培养时发现花粉管在花柱中生长时产生的信号使赤霉素增加(1983)的研究结果一致。自花授粉后24 h自交亲和品种花柱GA₃最高，自交不亲和品种花柱GA₃含量则无明显变化，而此时自交不亲和品种花粉管已停止生长，因此，较高的GA₃利于花粉管的生长。Leopold等(1980)和Smith(1985)研究认为IAA，CTK和GA能促进植物组织中游离多胺的合成，ABA则对多胺合成有抑制作用(Sasaki et al.，1976)，而多胺可以提高苹果自交亲和指数(徐继忠等，1998)，本研究中自交亲和的苹果品种早红香自花授粉后48~72 h(花粉管生进入到花柱基部)花柱促进细胞分裂、伸长生长的内源激素含量均增加，而加速花柱衰老的MDA和ABA含量下降，这与前人研究结果一致。3个自交不亲和的苹果品种和自交亲和的苹果品种早红香花柱(IAA+GA₃)/ABA峰值分别出现在自花授粉后12和24 h，此时自花授粉的花粉管均能正常生长，之后自交亲和品种早红香(IAA+GA₃)/ABA值高于自交不亲和品种，可能与较高的生长促进类激素和较低水平的ABA有利于苹果自花花粉管伸长有关。