秦岭细粘束孢(Leptographium qinlingensis)是华山松大小蠹(Dendroctonus armandi)成虫贮菌器携带的一种共生真菌，在华山松大小蠹入侵健康寄主华山松(Pinus armandi)时接种于树木韧皮部和木质部边材组织内，共同危害寄主树木的同时分解利用寄主树木的营养(陈辉等，2000)，在华山松纤维素和木质素底物的诱导下，可分泌纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和酸性磷酸酶(陈辉等，2004；Chen et al., 2007)，对华山松大小蠹在华山松上的定居具重要的作用。

大部分植食性昆虫如白蚁、小蠹虫、树蜂等都是以植物碎屑为食，但它们对这些物质难以消化利用，依靠其共生真菌对植物主要成分木质素和纤维素的降解而利用(Kobayashi et al., 2008)。张时妙等(2004)研究了啶虫脒、氰戊菊酯和硼酸3种药剂的亚致死剂量对白蚁体内纤维素酶活性的影响，探索用药物抑制纤维素酶从而达到控制白蚁的危害；Deng等(2008)比较了黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)及其共生真菌Termitomyces albuminosus的纤维素酶活性。殷幼平等(2004)分离纯化了桑粒肩天牛(Apriona germari)幼虫的内切葡萄糖苷酶并研究了其性质；索风梅等(2006)则详细报道了金属离子对松墨天牛(Monochamus alternatus)纤维素酶的影响，但是关于小蠹虫共生真菌的纤维素酶研究还鲜见报道。本文在前人研究的基础上，对秦岭细粘束孢分泌纤维素酶的组分、产酶条件进行研究，旨在进一步揭示秦岭细粘束孢纤维素酶代谢在华山松大小蠹入侵危害华山松中的作用。

1 材料与方法 1.1 供试菌种和培养基

供试菌种秦岭细粘束孢由西北农林科技大学林学院微生物研究室提供。供试培养基为麦芽汁培养基(pH5.0)(Kuroda，2005)，用于菌种的活化培养；不加琼脂的麦芽汁培养基作为发酵产酶培养基。

1.2 菌悬液的制备

将秦岭细粘束孢接种于麦芽汁培养基，27 ℃培养7天后加入无菌水洗下孢子，倒入装有玻璃珠的三角瓶中，振荡，用无菌水配成10⁶个·mL^-1的孢子悬液(Gao et al., 2008)。

1.3 粗酶液的制备和生物量的测定

在250 mL三角瓶中装100 mL发酵产酶培养基，接入孢子悬液3 mL，27 ℃、110 r·min^-1，振荡培养6天。发酵液于4 ℃，5 000 r·min^-1离心10 min，上清液即为粗酶液。菌丝体置于滤纸上真空抽滤，用无菌去离子水冲洗，80 ℃烘至恒质量后称其干质量。

1.4 产酶条件的优化

将上述制备粗酶液的温度设为20，23，25，27，29和31 ℃(pH5.0，110 r·min^-1，6天)，时间为2，4，6，8，10和12天(pH5.0，27 ℃，110 r·min^-1)，pH为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0(27 ℃，110 r·min^-1，6天)，转速为90，110，130，150和180 r·min^-1(27 ℃，pH4.5，6天)，分别检测不同温度、不同时间、不同pH和不同转速对产酶的影响。在上述单因素试验的基础上做4因素(温度、时间、pH值、转速)3水平的正交试验。

1.5 纤维素酶活性测定

完整的纤维素酶是由作用方式不同但能相互协同催化水解纤维素的3类酶组成，即内切葡萄糖苷酶(简称C_X，EC3.2.1.4)；外切葡萄糖苷酶(简称C₁，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(简称BG，EC3.2.1.21)(Wood et al., 1978)。总纤维素酶(FPase)以50 mg新华滤纸为底物；C_X用2 %(W/V)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物；C₁用2%(W/V)微晶纤维素为底物；BG用2%(W/V)水杨苷为底物，均用0.05 mol·L^-1、pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制。反应体系加1.5 mL底物和0.5 mL粗酶液，50 ℃保温(FPase酶60 min，其他酶30 min)，迅速用流水冷却至室温；再加入3 mL DNS沸水浴5 min，显色后稀释至20 mL，于752N型紫外可见分光光度计上测定OD_{540 nm}值(Ghose，1987)。以每毫升酶液每分钟产生1 μg葡萄糖(不含发酵液中的还原糖)定义为一个酶活单位(U)。以上试验均重复3次。

1.6 数据处理

采用Excel(Ⅴ2003)软件进行统计分析并绘图。

2 结果与分析 2.1 培养温度对产酶的影响

随着培养温度的升高，C_X，C₁和FPase酶活先升高后降低，C_X在27 ℃时酶活达到最高(2.913 U)，C₁和FPase的酶活在29 ℃和23 ℃时达到最高。低于25 ℃时检测不到C₁酶活性，这可能是温度较低影响菌丝体的旺盛生长，故所产酶活较低。但是BG酶活性则随着温度的升高而降低，29 ℃时检测不到BG酶活性。31 ℃时4种酶活性均已检测不到(图 1a)，说明秦岭细粘束孢在低温条件下产酶效果较好。各种温度条件下C_X的酶活性均高于其他酶，是秦岭细粘束孢分泌的主要纤维素酶种类，为此本试验选取C_X酶为主要参照对象进行优化。

2.2 培养时间对产酶的影响

培养时间对酶活影响较大，培养初期(2~4天)的酶活较低，这一时期应是秦岭细粘束孢的适应期和快速生长阶段。培养前期(4~6天)随时间增加菌量逐渐增加，此阶段菌体生长旺盛，产酶量也在增大，酶活随之升高。培养6天时，C_X酶活和生物量均达到最高，酶活为8.785 U，生物量为6.088 g·L^-1。6天后产酶能力迅速下降、生长减慢。至第8天生物量略有上升，而8天后则继续下降；此时，随着时间的增加，菌体生物量和酶活均呈下降趋势。培养8天时FPase，BG，C₁的酶活达到最高，比最大生物量有所滞后；8~10天的酶活相对较稳定(图 1b)。

2.3 培养基起始pH对产酶的影响

当培养基起始pH在3.5~5.0时，随着pH升高酶活呈上升趋势；当pH为5.0时C₁，BG和FPase酶活达到最高，分别为3.560，0.740和0.740 U；而C_X最大酶活值出现在pH4.5，为35.511 U；在pH4.5~5.5的范围内C_X基本保持稳定；pH超过5.5时，酶活急剧降低；说明偏酸性(pH4.5~5.5)条件适合该菌产酶。起始pH低于4.0时，产酶能力弱，且酶易失活；在pH5.5~6.5范围内，随着pH增大，酶活急剧下降(图 2a)。

2.4 摇床转速对产酶的影响

当摇床转速为90 r·min^-1时检测不到酶活性；当摇床转速为150 r·min^-1时产BG，FPase效果最佳，低于或高于此转速，产酶水平都会下降，但是产C_X，C₁最佳效果的转速为110 r·min^-1。C_X酶活在110~130 r·min^-1之间基本稳定，而在150 r·min^-1时其酶活仅为110 r·min^-1时的49 %；在180 r·min^-1时则已检测不到C_X酶活，此时所测的C₁，BG酶活也分别只有最高酶活的41%，46%。转速太高会导致机械剪切力过大而造成菌丝断裂，使其生长受到抑制进而影响到产酶水平，为此本研究选择130 r·min^-1为最佳转速(图 2b)。

2.5 正交试验

从表 1可以看出，秦岭细粘束孢可以分泌内切葡萄糖苷酶(C_X)、外切葡萄糖苷酶(C₁)和 β-葡萄糖苷酶(BG)，具有完整的纤维素酶系；其中C_X酶活相对较高，是主要的纤维素酶组分，优化后C_X的最大酶活分别是C₁和BG最大酶活的13.662倍和8.780倍。正交试验得出秦岭细粘束孢分泌C_X，C₁和BG的最适条件各不相同。产C_X最佳条件为：29 ℃、6天、起始pH4.0、摇床转速150 r·min^-1；产C₁最佳条件为29 ℃、5天、起始pH5.0、摇床转速130 r·min^-1；产BG最佳温度为25 ℃，其他条件同C₁。此外，4个因素对各酶活的影响各不相同，按极差R值的大小排列顺序如下：1)FPase和C₁：温度>转速>起始pH>时间；2)BG：温度>时间>转速>起始pH；3)C_X：转速>温度>时间>起始pH。总的来看，对该菌产酶影响最大的因素是温度，其次是转速和时间，起始pH对该菌的产酶影响最小。

3 结论与讨论

温度对秦岭细粘束孢产纤维素酶的影响最大，温度的变化决定了秦岭细粘束孢分泌纤维素酶的种类、相对酶活的大小及3种酶活的比例；这也间接说明不同温度条件下，秦岭细粘束孢的代谢对寄主树木的影响不同，对华山松大小蠹入侵时的协助作用亦有相应变化，因此与华山松大小蠹入侵的时空分布有一定关系。Hicke等(2006)曾指出环境温度的变化影响黑山大小□(Dendroctonus ponderosae)的暴发。Six等(2007)也发现黑山大小蠹和它的2种共生真菌Grosmannia clavigera，Ophiostoma montium之间的关系随温度不同有很大变化。Hofstetter等(2007)的研究亦表明小蠹虫对树木的侵害随时间的变化而变化，其共生真菌会随温度、树木释放的化学物质、及其他微生物的不同而有所变化。叶辉(1997)通过研究发现纵坑切梢小蠹(Tomicus piniperda)的主要伴生菌Leptographium wingfieldii在不同温度下对苏格兰松(Pinus sylvestris)的侵染力和致病力有差别。

蠹害的发生是小蠹虫对树木的危害、寄主树木的防御反应以及共生菌的侵染三者相互作用的结果，因此有效防治要从虫、菌、树三者来研究。Yamamoto等(1986)指出纤维素酶的作用会导致松树萎蔫；Kuroda(2005)发现蓝变菌Ceratocystis polonica的次生代谢产物会影响日本云杉(Picea jezoensis)的水分流动，最终使其失水萎蔫；谢寿安等(2007)也报导了蓝变真菌C. polonica分泌的纤维素酶能利用寄主欧洲云杉木质部的纤维素，是阿尔卑斯山境内欧洲云杉(Picea abies)致死的重要病原菌。这都说明真菌的代谢产物尤其是纤维素酶对寄主树木的抗性有很强的破坏力，对小蠹虫危害寄主树木起重要作用。Li等(2005)提出通过对红火蚁(Solenopsis invicta)肠道共生细菌的研究来寻找新的红火蚁生物防治方法。同样也可以从真菌的角度来探索通过药物抑制共生菌产生纤维素酶，从而达到对小蠹虫更有效的生物防治。此外，蚀木性害虫体内以及与其共生的真菌中含有的丰富纤维素酶源，值得进一步研究探讨与利用。