地被菊(Dendranthema grandiflorum)是20世纪80年代由陈俊愉院士首先提出的菊花新品种群(王彭伟等，1990；Chen et al., 1995)，因株型低矮或匍匐、多分枝、抗性强、适应性广、成型快、覆盖能力强、着花繁密，同时具备绿化、美化、彩化和香化功能，园林应用前景广阔(于忠香，2004)。株型是地被菊的重要性状之一，匍匐型地被菊因枝条分枝角度小，匍匐地面生长，更适于地被景观营造。目前，株型遗传控制和分子标记研究集中在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，及水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等大田作物和番茄(Lycopersion esculentum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)等蔬菜作物上(嵇怡等，2006；张培通等，2006；李培金等，2003)，观赏植物株型遗传和分子标记鲜有研究，地被菊株型匍匐性的分子标记尚未见报道。

在前期利用BSA法构建基因池筛选到了与地被菊匍匐性连锁的RAPD标记A10₅₅₅，经单株检测发现，该标记与地被菊株型匍匐/直立位点遗传距离为7.96 cM(赵静媛等，2009)。但由于RAPD标记重复性及稳定性稍差，在实际应用中受到一定限制。而SCAR标记是根据RAPD标记的片段序列，合成1对特异性引物，对基因组进行扩增，以揭示基因组之间的多态性。较长的引物有效地减少了非特异性扩增，提高了SCAR技术的稳定性。所以，在分子标记辅助选择育种实践中常常将RAPD标记转化为更稳定的SCAR标记(许勇等，2000；马少芹等，2006；王道杰等，2006)。本研究将获得的与地被菊匍匐性状控制基因相连锁的分子标记转化为更稳定而有效的SCAR标记，为匍匐型地被菊新品种选育、分子标记辅助育种和匍匐性相关基因的克隆奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 试材

供试材料为保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”的亲本地被菊品种03(6)-12(株型为接近匍匐的中间型)和盆栽小菊品种‘早意大利红’(Dendranthema grandiflorum)(株型为接近直立的中间型)及其以‘早意大利红’(P1)为母本、03(6)-12为父本(P2)杂交获得的152株F₁群体，其中36株匍匐，75株为中间型，41株直立。

1.2 DNA提取

取植株嫩叶，采用CTAB微量法提取基因组DNA(邹喻萍等，2001)，Lambda DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，最后将浓度调至20 ng·μL^-1。

1.3 特异片段的回收、克隆和测序

利用已筛选出的引物A10扩增与地被菊匍匐性连锁特异片段，PCR扩增反应在MJ Research公司生产的PTC-100^TM型PCR仪上进行。用手术刀切下含有特异片段的琼脂糖凝胶块，采用大连宝生生物公司的DNA纯化回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0)回收纯化。回收片段与上海英骏生物技术有限公司提供的pGEM-T Easy Vector质粒载体连接后转化大肠杆菌DH5α，参照文献(萨姆布鲁克等，2003)进行重组质粒的转化和筛选。采用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取重组质粒，PCR方法进行检测。委托上海英骏生物技术有限公司测序和合成引物。

1.4 SCAR标记引物的设计与扩增

在A10₅₅₅片段两端包括RAPD引物的10个bp再延长8~14 bp，设计4对引物，并检查其是否符合引物与模板的序列紧密互补，引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物不能在模板的非目的位点产生聚合反应的引物设计一般条件。利用设计的特异引物进行SCAR扩增，25 μL的反应体系中含有2.5 μL 10×buffer，1.5 μL 25 mmol·L^-1 MgCl₂，2.0 μL 2.5 mmol·L^-1 dNTP，1 U Taq DNA聚合酶，1.5 μmol·L^-1 SCAR引物，20 ng模板DNA，余下用ddH₂O补充。

PCR反应程序为94 ℃ 5 min预变性；然后94 ℃ 1 min，67 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保温。取7 μL扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，电极缓冲液为1×TAE，电压5 V·cm^-1。利用JS-380凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)进行观察拍照，记录多态性片段。

2 结果与分析 2.1 特异性RAPD标记片段的回收纯化

采用低熔点琼脂糖胶回收RAPD标记特异片段A-10₅₅₅，用TaKara回收试剂盒纯化回收片段，纯化产物利用RAPD引物A10进行2次PCR扩增，电泳检测结果如图 1。电泳结果表明回收的DNA片段分子质量单一，没有其他杂带，纯化后的条带没有拖尾，纯化效果理想，全长约555 bp。将纯化的RAPD目标片段连接到PGEM-T easy Vector，转化到感受态细胞中，活化以后均匀涂布于含Amp抗生素的LB琼脂培养基上，利用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的办法，进行蓝白斑筛选，挑选重组质粒。

2.2 特异片段A-10₅₅₅的序列测定及SCAR引物设计

目标片段经回收纯化后，进行了克隆测序，特异片段A-10₅₅₅的测序结果见图 2，从序列图的上下游找到了引物A10自身及其互补碱基序列的位置。除去接头部分序列后，所得特异片段长度为555 bp，根据RAPD标记特异片段序列，利用Oligo 6 Demo和Primer Premier 5.0软件在不同区域设计4对SCAR引物，对F₁分离群体的单株进行SCAR标记验证。其中引物1：上游引物序列为5′-GTGATCGCAGGAACAACCTCGGAG-3′，下游引物序列为5′-GTGATCGCAGCCCCTTGAAACAAT-3′；引物2：上游引物序列为5′-GAACAACCTCGGAGACAA-3′，下游引物序列为5′-TTAATCCCAATGGTGAGTG-3′；引物3：上游引物序列为5′-GTGATCGCAGGAACAACC-3′，下游引物序列为5′-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3′。引物4：上游引物序列为5′-GCCAGGGGAGCGGACGGGATAATG-3′，下游引物序列为5′-TGTCCGCAGTCAATGTGGGGAAAG-3′。引物1，2，4进行PCR扩增时设置了不同退火温度梯度，但即使在提高了退火温度情况下，引物在所供试分离群体的单株中均扩增出了大小相同的条带，多态性消失。而引物3在67 ℃退火35个循环的条件下获得较好的扩增结果，且与标记A-10₅₅₅的扩增结果完全一致，表现共分离，PCR扩增产物大小为555 bp。

2.3 SCAR引物对亲本及152 F₁单株的PCR分析

用特异SCAR引物3在两亲本、152株F₁群体(36株匍匐，75株中间型，41株直立)进行PCR扩增、验证。部分结果见图 3和图 4，标记的分离情况见表 1。从图可以看出，两亲本及F₁单株中匍匐型和中间型个体扩增出1条555 bp的特异性条带，而直立个体无此带。经2~3次重复试验发现在152个F₁单株中，有111株扩增到SCA10₅₅₅，41株没有扩增出此带，有12株重组，且12株重组个体与RAPD引物A-10扩增产生的重组个体完全一致，说明此RAPD标记已被成功转化为SCAR标记，是与地被菊匍匐基因连锁的SCAR标记，命名为SCA10₅₅₅。

3 讨论

RAPD标记通常为500~1 500 bp，相对容易转换成快速、稳定的SCAR标记(Barret et al., 1998)。如许勇等(2000)找到了与西瓜(Citrullus lanatus)抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01₇₀₀并转化为SCAR标记，且建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术体系。王成等(2007)应用RAPD技术结合BSA法获得了一个与桃(Amygdalus persica)花粉可育基因连锁的RAPD标记OPW03₉₀₀，并将其成功转化为SCAR标记SCW03₉₀₆。王国臣等(2007)利用DH系群体和BSA法筛选到与橘红心球色基因or连锁的RAPD标记S1338₆₅₆和AFLP标记P67M54₁₇₂，其遗传距离分别为8 cM和13 cM，并将其成功转化成SCAR标记SCOR₂₀₄和SCOR₁₂₇。马少芹等(2006)采用BSA法和RAPD技术在F₂代建立抗感基因池，获得了与西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因连锁的分子标记，遗传连锁距离为8 cM，命名为AK13_-644，将此RAPD标记成功转化成SCAR标记SCAK13_-644。

在将RAPD标记转化为SCAR标记时常出现多态性消失的现象(王道杰等，2006；Scovel et al., 1998)，因为RAPD扩增多态性可能是引物位点几个核苷酸序列差异或扩增片段序列内结构重排的结果(Paran et al., 1993)，由引物结合区的序列差异导致的多态性片段进行SCAR转化时，在退火温度不够高、体系不够严谨的情况下，可能不表现多态性(姜立杰等，2005)。原因可能是：用10碱基的随机引物进行RAPD扩增时，引物与模板发生错配，不能引发DNA扩增，而转化为SCAR标记后，引物3′端增加了10~14个碱基，增强了引物与模板的结合能力，克服了引物在5′端的错配，从而引发DNA扩增，使原有的多态性消失。根据相关研究表明，解决SCAR转化时多态性消失的方案主要有：1)适当缩短引物的长度。Vidal等(2000)提出根据测序结果在10碱基随机引物的3′端只增加4~8个碱基，可检测到原有的多态性，同时提高了扩增的稳定性。2)适当提高扩增时的退火温度(姜立杰等，2005)。3)对于两等位基因间单碱基的差异，可利用核酸酶裂解和变性梯度凝胶电泳等方法鉴别(Meyers et al., 1987)。在本研究中，一开始利用24 bp长度引物进行扩增，发现RAPD显示的多态性消失。之后，将设计引物的长度缩短为18 bp，退火温度提高到67 ℃时，成功将RAPD标记转化成了SCAR标记。据此推测，本试验获得的多态性标记可能主要是引物序列内几个核苷酸碱基的差异，同时也验证了适当提高扩增时的退火温度和缩短引物长度是成功将RAPD标记转化为SCAR的有效方法。本研究获得的SCA10₅₅₅标记在152个F₁单株中得到了验证，所筛选的SCAR标记稳定性好，可以克服RAPD标记不稳定、不易重复等缺点，将其用于匍匐性地被菊的新品种选育，对缩短育种周期、提高育种进程有积极意义。