植物所含营养成分的质和量及种类繁多的次生代谢产物，对昆虫选择食物的活动有很大影响(钦俊德等，2001)。氨基酸是昆虫生长发育不可缺少的生物活性物质，其含量过低或各种氨基酸的相对比例不均衡，都会影响昆虫的正常生长发育和繁衍(彩万志，2001；王荫长，2001)。Leckstein等(1974)发现，氨基酸在豆卫矛蚜(Aphis fabae)选择和利用寄主中发挥重要作用，如果将人工合成饲料中的氨基酸剔除，豆卫矛蚜专食性种群类型的繁殖量下降，而其广食性种群类型的繁殖量不受影响(Tosh et al., 2003)。研究表明:杨树(Populus)木质部氨基酸相对含量越高，越利于天牛幼虫的生长发育(严善春等，2006)；天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸均具有刺激害虫吸食的作用(徐福元等，2000)；氨基酸总体含量的减少可作为松树(Pinus)诱导抗性的1个指标(刘兴平等，2003)。

植物体内所含的氨基酸中游离氨基酸占有相当大的比例(黄晓德等，2006)，在叶部的游离氨基酸总量最高(张金林等，2004)。植物果实中的氨基酸是蛋白质的重要组成部分，随着植物结实量的增加，氨基酸大量储藏于果实中(王建等，2000)，引起植物其他部位氨基酸的含量变化，可能影响到植物的抗病虫害能力。为探索2种落叶松不同结实等级情况下针叶内游离氨基酸含量的变化，本试验采用柱前衍生高效液相色谱法对兴安落叶松(Larix gmelinin)和长白落叶松(L.olgensis)4种结实情况下针叶内游离氨基酸含量变化进行分析，了解落叶松不同结实及不同种类针叶内游离氨基酸的含量及其动态过程，有助于采取适当措施调控落叶松的营养配比，增强树木抗虫性，为保护树木提供新的资料。

1 材料与方法 1.1 针叶样品采集

针叶样品采自黑龙江省牡丹江市林口县青山林场落叶松种子园的优树收集区。该种子园占地569 hm²，其中优树收集区占地7.75 hm²，落叶松生长状况良好。选择在结实小年情况下同一立地条件下的20年生兴安、长白2种落叶松，在树冠中部的东、南、西、北4个方向上各选取有结实的树枝(刘足根等，2007)，根据从枝梢起1 m长枝段上的平均球果数量，将样树划分成无结实Ⅰ、结实较少Ⅱ、结实中等Ⅲ、结实较多Ⅳ 4个等级(王有才等，2000)(表 1)。每个结实等级选择12株样树，将每株样树的树冠分为上、中、下3部分，在每部分的东、南、西、北4个方向，即12个方位采摘针叶，将同株样树上所采摘的针叶充分混合，均匀分成3等份装入拉链塑料袋内，迅速放入冰盒带回室内冷藏待测。

1.2 仪器与试剂

仪器：2695高效液相色谱仪、2996二极管矩阵检测器(PDA)和氨基酸分析柱(美国Waters公司)、旋转蒸发仪(上海夏荣生化仪器厂)、D-37520冷冻离心机(德国)、真空过滤器(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)、电子天平(奥豪斯国际贸易上海有限公司)、超声波清洗器(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)。试剂：甲醇和盐酸(分析纯，天津光复科技发展有限公司)、AccQ·Fluor衍生试剂包、AccQ·Fluor硼酸缓冲液和氨基酸标样(美国Waters公司)、乙腈(色谱纯，Burdick and Jackson公司)。

1.3 针叶样品的水解

将针叶在55 ℃的烘箱内烘干，用高速万能粉碎机将其粉碎至粉末，过60目筛。精确称取粉末1.5 g于洁净三角瓶内，加入25 mL甲醇和5 mL 0.1 mol·L^-1 HCl，30 ℃超声波震荡60 min；4 ℃，12000r·min^-1离心12 min；吸取上清液，旋转蒸发浓缩至约2 mL，1次吸取1 mL于10 mL样品瓶内，向其中加入1.5 mL 0.02 mol·L^-1 HCl溶液；用0.45 μm滤膜过滤，滤液储存于洁净10 mL样品瓶中。

1.4 游离氨基酸测定 1.4.1 衍生化试剂的配制

取1 mL AccQ·Fluor稀释液(2B)加入衍生剂粉(2A)中，涡旋10 s，在55 ℃水浴锅中水浴，水浴时间不超过10 min(AccQ·Fluor衍生剂最长保存时间不超过1周)。

1.4.2 标准样品的配制

取40 mL Waters氨基酸水解液标准(H)放入干净的自动进样瓶中，再加入960 μL超纯水(MQW)，获取0.1 mmol·L^-1氨基酸标样溶液(CS)(其中胱氨酸为0.05 mmol·L^-1，-20 ℃可以储存1个月)。吸取10 μL氨基酸标样溶液，加入70 μL AccQ·Fluor于衍生化试管中，立即涡旋混合数秒，室温放置10 min。之后放入微量进样瓶，即可测定。

1.4.3 试样的衍生

取已用滤膜过滤的样液20 μL，加入到衍生化试管中，再加入60 μL AccQ·Fluor硼酸缓冲液，涡旋混合10 s，向混合好的衍生化试管中加入20 μL AccQ·Fluor衍生试剂，立即涡旋混合数秒，放置1 min。用封口膜将衍生化试管封好，放在55 ℃的烘箱中加热10 min后，将衍生样品加入到微量进样瓶中，即可测定。

1.5 色谱条件

色谱柱为Waters氨基酸分析柱，流动相A为AccQ·Tag水溶液(AccQ·Tag溶液与超纯水溶液体积比为1:10)，流动相B为乙腈，流动相C为超纯水。流动相均经0.45 μm滤膜抽滤，超声脱气15 min，检测时保持用氦气在线脱气，流速为1.0 mL·min^-1，柱温为37 ℃，检测波长248 nm，进样量为10 μL，单次运行时间为45 min。以17种氨基酸标样为标准确定氨基酸的种类，根据峰面积、标准曲线计算样品氨基酸的含量。

1.6 数据处理

采用One-way ANOVA(单向方差分析法)分析结实量对同种落叶松针叶内游离氨基酸含量的影响，及Univariate(单因素变量多因子方差分析法)分析种类和结实量对落叶松针叶内游离氨基酸含量的影响，以LSD(最小显著法)对主要影响因素进行多重比较分析。

2 结果与分析 2.1 兴安落叶松针叶内游离氨基酸分析

兴安落叶松4个结实等级针叶内检测分析出17种游离氨基酸，其含量变化情况见表 2。随着结实量的变化，游离氨基酸总量的变化表现为Ⅱ级 < Ⅲ级 < Ⅰ级 < Ⅳ级，经LSD多重比较分析表明，在结实较少(Ⅱ级)时，游离氨基酸总量显著低于Ⅰ级和Ⅳ级的游离氨基酸总量(P_总Ⅰ×Ⅱ=0.036，P_总Ⅱ×Ⅳ=0.028)。17种游离氨基酸中，苯丙氨酸含量最大，占总量的86.29%~96.96%，其次是丝氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸，这3种氨基酸分别占到总量的0.67%~1.21%，0.67%~1.20%，0.35%~0.62%。半胱氨酸含量最小，仅占总量的0.03%~0.06%。经LSD多重比较分析表明，同一结实等级情况下，苯丙氨酸含量显著高于其余16种游离氨基酸含量(P_Ⅰ级 < 0.01，P_Ⅱ级 < 0.01，P_Ⅲ级 < 0.01，P_Ⅳ级 < 0.01)，但其余16种游离氨基酸含量无明显差异；不同结实等级情况下，丙氨酸含量Ⅲ级时显著低于Ⅳ级时(P_AlaⅢ×Ⅳ=0.050)、精氨酸含量Ⅱ级时显著高于Ⅲ级时(P_ArgⅡ×Ⅲ=0.037)、谷氨酸含量Ⅱ级时显著高于Ⅳ级时(P_GluⅡ×Ⅳ=0.045)、异亮氨酸含量Ⅱ级时显著低于Ⅳ级时(P_IleⅡ×Ⅳ=0.020)、赖氨酸含量Ⅰ级时显著低于Ⅳ级时(P_LysⅠ×Ⅳ=0.035)、苯丙氨酸含量Ⅱ级时显著低于Ⅰ级和Ⅳ级时(P_PheⅠ×Ⅱ=0.021，P_PheⅡ×Ⅳ=0.017)、缬氨酸含量Ⅰ级时显著低于Ⅳ级时(P_ValⅠ×Ⅳ=0.034)。

2.2 长白落叶松针叶内游离氨基酸分析

长白落叶松4个结实等级针叶内17种游离氨基酸的含量变化情况见表 3。随着结实量的变化，游离氨基酸总量变化表现为Ⅱ级 < Ⅰ级 < Ⅲ级 < Ⅳ级。经LSD多重比较分析表明，在结实较少(Ⅱ级)时，游离氨基酸总量显著低于Ⅳ级时游离氨基酸总量(P_总Ⅱ×Ⅳ=0.017)。同一结实等级情况下，17种游离氨基酸含量差异及百分含量占优势的氨基酸种类同兴安落叶松，区别在于精氨酸含量最小，仅占总量的0.05%~0.09%；不同结实等级情况下，天门冬氨酸含量Ⅰ级时显著高于Ⅲ级时(P_AspⅠ×Ⅲ=0.029)、苯丙氨酸含量Ⅱ级时显著低于Ⅳ级时(P_PheⅡ×Ⅳ=0.012)。

2.3 2种落叶松针叶内游离氨基酸比较分析

兴安落叶松和长白落叶松在4种结实等级情况下，针叶内17种游离氨基酸含量变化存在差异，但落叶松种类对游离氨基酸总量影响差异不显著(P>0.05)，只对天门冬氨酸含量影响差异显著(P=0.02)；经LSD多重比较分析表明，在结实较少(Ⅱ级)时，游离氨基酸总量显著低于其他3个结实等级时(P_总Ⅱ×Ⅰ=0.027，P_总Ⅱ×Ⅲ=0.032，P_总Ⅱ×Ⅳ=0.001)；苯丙氨酸含量比较与总量比较结果相同(P_PheⅡ×Ⅰ=0.007，P_PheⅡ×Ⅲ=0.018，P_PheⅡ×Ⅳ=0.001)。种类×结实量2个因子共同对游离氨基酸总量及每种氨基酸含量影响差异均不显著(P>0.05)(表 4)。

3 结论及讨论

植物结实过程中，其营养成分分配会发生巨大变化，使其生长、繁殖与防御功能得到相应的调节(沈嘉等，2007)。本研究发现：兴安落叶松针叶内丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和精氨酸含量在不同结实等级间差异显著；长白落叶松针叶内精氨酸含量最小，天门冬氨酸和苯丙氨酸含量在不同结实等级间差异显著。在植物的氮素代谢途径中，几乎所有氨基酸的生物合成均以谷氨酸为氨基的供体(刘胜群等，2007)，谷氨酸和天门冬氨酸是转氨作用中处于中心位置的不稳定氨基酸，在很多昆虫体内作为补充营养成分而处于重要地位(李镇宇等，2000)；苯丙氨酸、异亮氨酸和精氨酸3种游离氨基酸抑制昆虫的正常生长发育，如苯丙氨酸代谢途径可合成酚类化合物、植保素、木质素等防御物质(Christopher et al., 2004)，而酚是公认的植物次生抗虫物质。严善春等(2006)研究表明木质部中天门冬氨酸含量越高，越易引起青杨脊虎天牛的危害。精氨酸是昆虫所需的必需氨基酸(王荫长，2001)，郭树平等(2008)研究得出杨树韧皮部和木质部中精氨酸与被害率相关性较强，邹运鼎等(1990)通过对松针内氨基酸与马尾松毛虫生长发育关系的研究，认为高含量的异亮氨酸和低含量的精氨酸是影响马尾松毛虫生长发育的第一、第二限制因子，当马尾松苗木受害后其针叶内谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸和精氨酸含量均下降(邓文红等，2008)，这些研究表明：丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸均能促进昆虫的正常生长发育，因此，落叶松种类及结实量对几种游离氨基酸含量的影响势必会影响昆虫对落叶松的取食乃至生长发育。

兴安落叶松和长白落叶松均表现出结实较少(Ⅱ级)时针叶内游离氨基酸总量显著低于其他各结实等级时，结实较多(Ⅳ级)时针叶内游离氨基酸总量最高。这是因为果实内蛋白质的积累，主要来自于叶片的输送，在开花后去叶会显著减轻种子结实率(彭幼芬，1994)。张金林等(2004)认为植物叶部的氨基酸以游离氨基酸为主，输送到种子内的游离氨基酸主要以蛋白质的形式存在，叶部的游离氨基酸不断地向种子输送，才保证果实产量(彭幼芬，1994；王建等，2000)。以此推断，无结实(Ⅰ级)时，2种落叶松针叶内游离氨基酸含量应该最低，然而并非如此。无结实(Ⅰ级)时，兴安落叶松针叶内游离氨基酸的含量排在第3位，只低于结实较多(Ⅳ级)样树内游离氨基酸的总量，长白落叶松针叶内游离氨基酸的总量排在第2位，只高于结实较少(Ⅱ级)样树内游离氨基酸的总量，这可能是由于落叶松单株个体的某些限定因子，如树高、胸径、冠幅、侧枝数等因子使其自身繁殖受到限制(周永丽等，2008)，从而使针叶内游离氨基酸不能有效的运输到种实中。其具体的限定因子还有待于进一步研究。

种实的生长特性及其生理变化是生长发育规律的具体表现，也是生产实践中制定各种相应管理措施的科学依据。了解结实量对落叶松针叶内游离氨基酸含量的影响，可以帮助我们做好落叶松营养协调及害虫防御工作，提高经济产量，保护树木健康生长。