在自然界中，植物要面临病菌侵染、昆虫取食等一系列来自外界的压力，为了适应这种生态压力，植物必须将有限的资源合理地分配给生长繁殖和防御。

生长繁殖和防御对于资源的利用处于一种动态平衡状态，即一方对资源的利用量发生变化时，另一方也相应地产生反方向的变化，以维持资源总量的守恒。植物种子成熟的过程，就是植株营养器官的养料以可溶性的低分子化合物状态(如蔗糖、氨基酸等形式)运往种子，在种子中逐渐转化为不可溶的高分子化合物(如淀粉、蛋白质和脂肪等)并且积累起来的过程(Ussuf et al.，2001)。在这一过程中植物投入到生长繁殖的能量增加，并影响其对抵抗不利环境和虫害的能量投入(魏振，2007；陈波等，2003)，此时植物的防御能力将会发生变化。

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)是植物由初级代谢转为次级代谢的关键酶和限速酶(李荣花等，2005)，PAL在植物防御害虫侵害的过程中起重要作用，被认为是植物的一种防御性酶。在昆虫取食的胁迫下PAL催化苯丙氨酸合成肉桂酸进入苯丙烷代谢途径，合成酚类化合物、植保素、木质素等防御物质(Christopher et al., 2004)。多酚氧化酶(polyphemol oxidase，PPO)是广泛分布于植物体内的另一种防御酶，能够催化酚类化合物转化为醌，将昆虫食物蛋白中的必需氨基酸烷基化，使昆虫不能利用其营养(Tscharntke et al., 2001)。PPO还负责催化细胞壁中的大分子物质交联以加强壁的结构或修复受损的壁(Thaler et al., 2002)。植物蛋白酶抑制(plant protease inhibitors)中的胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitors，TI)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitors，CI)是与植物抗虫性关系最为密切的2种丝氨酸蛋白酶抑制剂(刘会香等，2005)，它们与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用，形成酶抑制剂复合物，削弱或阻断消化酶对食物中的蛋白质的水解消化作用，并刺激昆虫消化酶的过度分泌，使昆虫产生厌食反应，从而降低昆虫的体质量和生长速率(Ryan，1990)。以上4种物质常作为检验植物抗性的标志性物质(Bhattacharyya et al., 2007)。

本论文研究了兴安落叶松(Larix gmelinii)与长白落叶松(L. olgensis)，在结实量不同时其针叶内防御酶PAL、PPO和蛋白酶抑制剂TI、CI活性的变化规律，从而探讨落叶松种类及结实量与抗性的关系。

1 材料与方法 1.1 试验材料

2006年7月在黑龙江省青山林场落叶松种子园的优树收集区内，一次性采集植物材料。该种子园1964年开始营建，占地569 hm²，其中优树收集区占地7.75 hm²，落叶松品种丰富，有效地防止了近亲交配，增强了后代的繁殖能力且生长良好。选择同一立地条件下20年生健康的兴安落叶松、长白落叶松，在树冠中部的4个方向上选取有结实的树枝(刘足根等，2007)，根据1 m长枝条上的平均结果数量，将样树划分成结实较多Ⅰ(>80个)、结实中等Ⅱ(50~80个)、结实较少Ⅲ(30~50个)、无结实Ⅳ(< 30个)4个等级(王有才等，2000)。每个结实等级选择12株样树，在每株样树树冠的上、中、下和东、南、西、北12个方位采摘针叶，将同株样树上所采摘的针叶充分混合，均匀分成3等份装入拉链塑料袋内，迅速放入冰盒带回室内冷藏待测。

1.2 测定方法 1.2.1 PAL活性测定

酶液的提取：取1 g针叶鲜样，在液氮冷却条件下碾碎后，加入6 mL巯基乙醇(0.1 mol·L^-1)和10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液1 mL于冰浴中研磨匀浆，在4 ℃下10 000 r·min^-1离心10 min，取上清液为酶提液。

PAL活性测定：采用苯丙氨酸比色法，在5 mL反应体系中包括0.2 mL酶提液，3.8 mL硼酸缓冲液和1 mL 0.02 mmol·L^-1 L-苯丙氨酸溶液，设置不加苯丙氨酸的为对照，反应体系在40 ℃水浴中保温60 min后，用紫外分光光度计(Ultrospec 4300 pro，下同)，于290 nm下测定吸光度，以0.01为1个酶活单位(U·mg^-1)。以不加底物为对照(Zong et al., 2006)。

1.2.2 PPO活性测定

酶液的提取：取1 g针叶鲜样，加少许石英砂，在液氮冷却条件下碾碎后，加入7%的PVP 6 mL，充分研磨成匀浆并转入离心管。样品在30 ℃水浴中恒温3 min，加入400 μL的10% Triton X-100振荡摇匀，在4 ℃下以10 000 r·min^-1的速度离心15 min，上清液为酶提液。

PPO活性测定：采用咖啡酸比色法，取3 mL 2.92 mmol·mL^-1的咖啡酸(用磷酸缓冲液配制)，加入150 μL待测酶提液混合均匀，以不加酶液为对照，用紫外分光光度计，在470 nm波长下立即测定吸光度的值，每30 s记录1次，持续测定3~5 min，以0.01为1个酶活力单位[U·g^-1(FW)min^-1]测定吸光度的变化值(Felton et al., 1992)。

1.2.3 TI活性测定

抑制剂的提取：取1 g针叶鲜样，在液氮冷却条件下粉碎后，加入6 mL的Tris-HCl(0.5 mol·L^-1，pH 7.8)缓冲液，冰浴研磨至匀浆，4 ℃下以2 000 r·min^-1速度离心10 min，上清液为抑制剂提取液。

TI活性测定：TI活性通过胰蛋白酶活力降低来测定，取200 μL胰蛋白酶液(Sigma公司)和40 μL的抑制剂提取液，25 ℃水浴15 min，取100 μL水浴后的混合液，加入0.05 mol苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)(Sigma公司)缓冲液(0.05 mol的Tris-HCl pH 8.0和0.01 mol CaCl₂混合)2.9 mL，用紫外分光光度计在256 nm波长下测定吸光度值的变化，此方法参照徐伟(2006)并有改动。

1.2.4 CI活性测定

抑制剂的提取：取落叶松针叶鲜样1 g，在液氮冷却条件下粉碎后，加入5 mL含苯基硫脲(Fluka公司)的Tris-HCl缓冲溶液(0.5 mol·L^-1，pH=8.0)，冰浴研磨成匀浆，在4 ℃下以12 000 r·min^-1的速度离心10 min，上清液为抑制剂提取液。

CI活性测定：取胰凝乳蛋白酶液(Sigma公司)100 μL与抑制剂提取液160 μL混合，25 ℃水浴15 min，取100 μL水浴后的混合液，将2.9 mL的苯甲酰酪氨酸乙酯(BTEE)(Sigma公司)立即加入混合反应液中，用紫外分光光度计在253 nm波长下，测定吸光度值的变化，此方法参照徐伟(2006)并有改动。

1.3 数据分析

采用Univariate(单因变量的多因素方差分析法)分析树种及结实量对PAL、PPO、TI、CI活性的影响，以LSD(最小显著法)对主要影响因素进行多重比较分析。

2 结果与分析 2.1 结实量及树种对落叶松针叶内防御酶及蛋白酶抑制剂活性的影响

2种落叶松4个结实等级的针叶内PAL、PPO、TI、CI的活性有差异，落叶松种类对防御酶及蛋白酶抑制剂的活性影响差异不显著(P_PAL=0.457，P_PPO=0.340，P_TI=0.274，P_CI=0.859)，结实量对防御酶及蛋白酶抑制剂的活性影响差异极显著(P_PAL < 0.000 1，P_PPO < 0.0001，P_TI < 0.0001，P_CI < 0.0001)(表 1)。

2.2 结实量对落叶松针叶内防御酶活性的影响

2种落叶松4个结实等级的针叶内PAL、PPO活性均产生变化，酶活性随结实的减少而呈递增趋势，即：Ⅰ级 < Ⅱ级 < Ⅲ级 < Ⅳ级(表 2)。PAL活性的变化，Ⅰ级结实量与其他各等级情况下的PAL活性差异显著或极显著(P_{PAL Ⅰ*Ⅱ}=0.010，P_{PAL Ⅰ*Ⅲ}=0.002，P_{PAL Ⅰ*Ⅳ} < 0.000 1)；Ⅱ级与Ⅲ级结实量情况下PAL的活性差异不显著(P_{PAL Ⅱ*Ⅲ}=0.455)，与Ⅳ级结实量情况下PAL的活性差异极显著(P_{PAL Ⅱ*Ⅳ}=0.009)，Ⅲ级与Ⅳ级结实量情况下PAL的活性差异显著(P_{PAL Ⅲ*Ⅳ}=0.041)。PPO的活性，在Ⅳ级结实量情况下极显著高于其他各结实等级(P_{PPO Ⅰ*Ⅳ}=0.000 1，P_{PPO Ⅱ*Ⅳ}=0.000 1，P_{PPO Ⅲ*Ⅳ}=0.000 1)；结实Ⅱ级与结实Ⅲ级2种情况下，针叶PPO活性差异不显著(P_{PPO Ⅱ*Ⅲ}=0.065)，而结实Ⅲ级情况下，针叶内PPO活性与结实Ⅰ级的PPO活性差异极显著(P_{PPO Ⅰ*Ⅲ}=0.000 1)，且Ⅰ级结实量情况下，PPO活性与结实Ⅱ级针叶内PPO活性差异显著(P_{PPO Ⅰ*Ⅱ}=0.008)(表 2)。

2.3 结实量对落叶松针叶内蛋白酶抑制剂活性的影响

2种落叶松4个结实等级的针叶内TI、CI活性均产生变化，2种抑制剂活性随结实量的减少而呈递增趋势，即：Ⅰ级 < Ⅱ级 < Ⅲ级 < Ⅳ级(表 3)。TI活性的变化，Ⅰ级与其他各等级结实量情况下的TI活性差异极显著(P_TIⅠ*Ⅱ=0.002，P_TIⅠ*Ⅲ < 0.000 1，P_TIⅠ*Ⅳ < 0.000 1)；Ⅱ级与Ⅲ级结实量情况下的TI活性差异不显著(P_TIⅡ*Ⅲ=0.140)，与Ⅳ级结实量情况下TI活性差异极显著(P_TIⅡ*Ⅳ < 0.001)；Ⅲ级与Ⅳ级结实量情况下的TI活性差异极显著(P_TIⅢ*Ⅳ=0.002)(表 3)。CI活性的变化，结实量与其他各等级情况下的CI活性差异显著(P_CIⅠ*Ⅱ=0.005，P_CIⅠ*Ⅲ < 0.000 1，P_CIⅠ*Ⅳ < 0.000 1，P_CIⅡ*Ⅲ=0.026，P_CIⅡ*Ⅳ < 0.000 1，P_CIⅢ*Ⅳ < 0.000 1)，在Ⅳ级结实量情况下的CI活性显著高于其他各等级的活性变化(P_CIⅠ*Ⅲ < 0.000 1，P_CIⅡ*Ⅲ=0.026，P_CIⅢ*Ⅳ < 0.000 1)(表 3)。

3 讨论

植物所含的防御物质及营养成分的质和量对昆虫取食起着决定性作用(钦俊德等，2001)，方杰等(2007)研究发现不同无性系的美洲黑杨对分月扇舟蛾的抗性有较大差异。本研究发现防御酶、蛋白酶抑制剂活性在兴安落叶松和长白落叶松间无显著差异，但在不同结实量等级间差异显著。

研究表明，落叶松的结实受诸多条件影响。外部因素主要受林分密度、坡位、土壤等环境因子以及光照、水分等生态因子影响，在考虑到以上诸多因素的基础上，在采集植物材料时，选择同一种子园内，生存条件相同的样树进行采集，避免了外部因素对试验结果造成的偏差。此外，品系、种类等内部因素对落叶松结实也会造成较大影响(陈波等，2003)。然而，本研究结果表明：兴安和长白2种落叶松针叶内的防御蛋白活性并没有因种类不同而产生较大差异。从资源分配的角度分析，其原因可能是植物在未受到毁灭性攻击时，其生存的最主要目的是繁育后代，以保持其赖以生存的种群数量(王玉玲等，2006)。因此，在种子形成到成熟的整个过程中，即使它们受到一定程度病虫的侵害，植物也会将大部分资源投入到繁殖中，使可用于防御的资源受限，这些可利用的少部分资源还必须投入到不同的防御途径中(朱麟等，2005；Liu et al., 2008)，因此分配到每种途径中的可利用资源更少，所以即使其种类存在差异，同一结实等级下2种落叶松针叶内同种防御酶和蛋白酶抑制剂的活性差异仍不显著。

植物起防御作用的代谢物在植物体内的分配会随植物的生长时期的不同即植物的营养成分不同做出相应的调整，植物的抗虫反应也会发生相应的变化，使其生长或繁殖与防御等功能得到相应的调节(沈嘉等，2007)。兴安和长白2种落叶松在不同等级结实量情况下针叶内的PAL、PPO、TI、CI的活性随着结实量的增加而降低，说明林木在繁殖生长期需要消耗大量的物质能量，其体内的营养物质发生转移，这一过程削弱了落叶松的抗虫能力。在自然条件下，植物营养成分的消耗与防御虫害的代价会达到某种平衡，而这种平衡是通过本身对生长与防御的协调表达来实现的(王琛柱等，2007；祖元刚等，2006)，植物在这样的动态平衡调节中运送营养成分来维持正常的生长繁殖和保持对虫害的防御(Arnold et al., 2003)。以上说法与Wareing等(1981)提出的植物生长分化平衡理论(growth-differentiation balance，GDB)中认为的植物在生长和防御之间有一个生理上的交易是完全符合的，说明植物在结实情况下对虫害的防御能力会发生相应的变化，即结实量与抗虫性之间存在直接的关系。

落叶松结实时期，分配给繁殖器官的营养成分增多，投入到防御方面的减少。因此，应加强对处在结实这个抗虫能力薄弱时期的落叶松种子林的管护，采取科学的营林措施，科学施肥、适时修枝和间伐(魏振，2007)，全面提高落叶松的抗虫能力。明确植物营养与防御之间的相互关系及其机理将是今后的一个研究方向，可为害虫的生态调控和综合治理提供新的途径及理念(王琛柱等，2007)。