落叶松(Larix)种间杂交具有明显的杂种优势, 不同组合杂种优势不同, 不同地区最适合的杂交组合也不同. 目前, 黑龙江省已经选育出了一批能适应一定环境、速生丰产、抗逆性强的优良落叶松杂种家系. 但是落叶松存在生长周期较长、有性繁殖后代变异较大、扦插等无性繁殖生根率低等问题, 所以对一些优良性状难以维持. 体细胞胚发生具有数量多、繁殖速度快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等特点, 是植物大规模无性繁殖的一种主要手段. 目前已有欧洲落叶松(L.decidua) (von Aderkas et al., 1990; Lelu et al., 1994a)、日本落叶松(L.kaempferi)(von Aderkas et al., 1990; 吕守芳等, 2005)、欧洲落叶松×日本落叶松(L.decidua×L.kaempferi)(Klimaszewska, 1989)和日本落叶松×欧洲落叶松(Larix×leptoeuropaea) (Lelu et al., 1994b)、美国西方落叶松(L.occidentalis)(Thompson et al., 1992)、北美落叶松(L.laricina)(Klimaszewska et al., 1997)、华北落叶松(L.principis-rupprechtii) (齐力旺等, 2000)建立了较稳定的体细胞胚发生体系, 而日本落叶松×兴安落叶松(L.kaempferi × L.gmelinii)和日本落叶松×长白落叶松(L.kaempferi × L.olgensis)等适合于中国东北地区生长的杂种落叶松的体细胞胚发生研究还未见报道.

本文以杂种落叶松未成熟合子胚为外植体, 进行胚性愈伤组织的诱导, 并通过体细胞胚发生途径形成再生植株, 为杂种落叶松优良种质繁殖奠定基础.

1 材料与方法 1.1 试验材料

杂种落叶松种子采自黑龙江省林口县青山种子园, 采种母树分别为日本落叶松3 ×兴安落叶松2、日本落叶松12 ×兴安落叶松9、日本落叶松3 ×兴安落叶松9、日本落叶松5 ×兴安落叶松9、日本落叶松5 ×长白落叶松77-3五个家系的优良单株. 自由授粉合子胚采集时间为2006年6月6日(授粉后37天左右)、6月27日(授粉后58天左右)、7月4日(授粉后65天左右)、7月12日(授粉后73天左右)、7月19日(授粉后80天左右)、7月28日(授粉后89天左右), 以确定最佳外植体采集时间. 采下的球果用塑料袋密封放入冰盒带回实验室, 保存于4 ℃冰箱备用, 1周内接种.

1.2 外植体的消毒

除去种鳞, 选择成熟、饱满的落叶松种子, 剥去种皮后, 在超净台中先用70%酒精消毒1 min, 转入30% H₂O₂中滴入3滴吐温20, 震荡, 消毒30 min, 无菌水冲洗3次, 接种备用.

1.3 接种

用2种方法进行接种. 一种方法是: 用解剖刀将去皮种子纵切后, 将胚乳一起接种于培养基上; 另一种方法是: 剥去胚乳挑出合子胚接种于培养基上. 授粉后37~73天采集的种子其合子胚不容易与胚乳组织剥离, 采用第1种方法. 授粉后80~89天采集的种子其合子胚已经达到子叶期, 相对容易分离, 采用第2种方法.

1.4 胚性愈伤组织的诱导

胚性愈伤组织诱导培养基为S, MS, LM, LP 4种, 分别添加0.5, 1.0, 2.0 mg·L^-1 2, 4-D, 0.5 mg·L^-1 KT, 0.5 mg·L^-1 6-BA, 450 mg·L^-1谷氨酰胺, 500 mg·L^-1水解酪蛋白, 6 g·L^-1琼脂(Sanland Inc), 30 g·L^-1蔗糖. 每个培养瓶中接种5~10个, 每个处理重复3次. 暗培养, 培养室温度保持在(25±1) ℃. 6~8周统计胚性愈伤组织诱导率.

1.5 胚性愈伤组织的增殖与维持

培养40~60天后, 将诱导出的胚性愈伤组织转入植物生长调节物质降到诱导时1/5的S培养基上进行继代培养, 继代周期为14天. 暗培养, 培养室温度(21±1) ℃.

1.6 体细胞胚的成熟与植株再生

挑取3个胚性系的生长势较好的胚性愈伤组织, 在不含植物生长调节剂的BM培养基上培养7天后, 转移至体细胞胚成熟培养基上进行成熟培养. 每个培养瓶中接种3团胚性愈伤组织, 每块愈伤组织团12 mg左右, 每个胚性系重复3次. 使用的培养基为BM培养基, 添加30 mg·L^-1 ABA, 450 mg·L^-1谷氨酰胺, 500 mg·L^-1水解酪蛋白, 60 g·L^-1蔗糖, 7 g·L^-1琼脂. 暗培养. 培养6~8周后, 选取形态正常、比较接近合子胚的子叶胚(每个胚性系30个体细胞胚), 水平放置于添加20 g·L^-1蔗糖, 4 g·L^-1琼脂的1/2 MS培养基上进行萌发. 光照时间16 h·d^-1, 光照强度36 μmol·m^-2s^-1. 40天后调查体细胞胚的萌发数与生根数, 计算萌发率与植株再生率, 并进行方差分析, 用Duncan法进行多重比较.

以上培养基pH值用NaOH和HCl调至5.8, 121 ℃高压灭菌20 min, 谷氨酰胺、ABA经过滤灭菌后在培养基温度降至50 ℃以下加入. 培养室温度(21±1) ℃.

每克愈伤组织形成体细胞胚数(个·g^-1)=形成子叶胚个数/接种时. 愈伤组织鲜质量; 萌发率(%)=萌发体细胞胚个数/接种体细胞胚个数×100%; 植株再生率(%)=生根的植株数/接种体细胞胚个数×100%.

1.7 再生植株的移栽

待体胚形成的苗上顶芽伸长, 根长超过2 cm后, 从瓶中取出幼苗, 洗净根部的培养基, 将其移栽到含有灭过菌的砂子和草炭土(质量比1:2)的小容器中. 容器顶部覆盖着透明塑料来保持较高的湿度, 培养室保持在(21±1) ℃, 光照时间16 h·d^-1, 光照强度36 μmol·m^-2s^-1. 放置6周, 然后将塑料盖拿掉. 移栽3个月后调查成活率.

2 结果与分析 2.1 胚性愈伤组织的诱导

授粉后37~73天采集的合子胚未与胚乳分离, 在培养的过程中表面观察不到合子胚的变化. 在4周内, 多数外植体无变化, 只有少数外植体膨大变成灰褐色, 这些外植体能够形成胚性愈伤组织. 5~8周后, 透明的愈伤组织从胚乳切口处伸出, 有粘性, 生长较缓慢, 极易褐化死亡(图版Ⅰ-1). 这种愈伤组织在解剖镜下观察由弯丝状细胞组成, 经培养能形成体细胞胚, 为胚性愈伤组织. 显微镜镜检为二倍体, 说明是由合子胚发育而来的. 授粉后80~89天采集的种子, 其合子胚已经达到子叶期, 相对容易分离, 用解剖刀剥去胚乳, 将合子胚直接接种于培养基上, 约2周后先后从胚根端、胚轴表面、子叶端产生不同类型的愈伤组织. 一是从胚根端、胚轴表面产生乳白色、半透明粘状愈伤组织, 在解剖镜下观察表面为透明丝状细胞, 不容易与其他愈伤组织分离, 增殖较慢, 如果不将其分离, 约1个月左右这种愈伤组织消失, 将此种愈伤组织转入无植物生长调节剂的培养基培养后在显微镜下观察有胚性胚柄细胞团(ESM)结构, 但没有观察到进一步发育. 此类愈伤组织也为胚性愈伤组织. 二是从子叶产生黄绿色愈伤组织, 结构松散, 无粘性, 在解剖镜下观察没有透明丝状结构, 此类愈伤组织增殖较快, 在愈伤组织团中的比例迅速增加. 此类愈伤组织进行培养不能产生ESM结构, 为非胚性愈伤组织.

本次试验只在6个处理中得到了胚性愈伤组织, 胚性愈伤组织的诱导率均较低(表 1). 授粉后65天采集的合子胚在添加0.5 mg·L^-1 2, 4-D + 0.5 mg·L^-1 6-BA + 0.5 mg·L^-1 KT的S培养基上诱导率最高, 也只有10%. 本次试验中采种母树基因型影响未成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导能力, 日本落叶松5×长白落叶松77-3家系比其他4个家系较容易诱导出胚性愈伤组织, 在4个时期采集的合子胚均诱导出了胚性愈伤组织. 不同时间采集的合子胚诱导的愈伤组织类型不同, 只有在授粉后65天以前采集的合子胚诱导出的胚性愈伤组织得到了长期的继代增殖, 并能够保持胚性. 在本次试验选用2, 4-D的浓度范围内, 高浓度的2, 4-D不利于胚性愈伤组织的诱导, 所有2, 4-D浓度为2.0 mg·L^-1的处理都未诱导出胚性愈伤组织. 本试验选用的4种培养基中, 发现在LP培养基上没有诱导出胚性愈伤组织, 在LM培养基上只有授粉后89天后采集的合子胚诱导出了胚性愈伤组织, 在MS和S培养基上, 得到了相对较多的胚性愈伤组织, 说明在选用的几种培养基中, MS和S培养基比较适合于杂种落叶松胚性愈伤组织的诱导(表 1).

2.2 胚性愈伤组织的维持与增殖

胚性愈伤组织在诱导出的最初几周增殖速度较慢, 而且胚性状态不稳定, 在不断的继代中, 部分胚性系褐化死亡; 部分胚性系在不断的继代中原来的胚性愈伤组织会转变为淡黄色不透明的愈伤组织而失去胚性; 其中有1个胚性系能够长期继代保持透明状态, 但不能增殖. 胚性愈伤组织经4周继代培养, 存活的愈伤组织增殖速度逐渐加快, 白色透明丝状的胚性愈伤组织不断在表面产生, 且继代后增殖比较平稳(图版Ⅰ-2). 最后只保留下了3个增殖比较稳定的胚性细胞系, 将其进行编号(表 1).

2.3 体细胞胚的成熟与植株再生

胚性愈伤组织在不含植物生长调节剂的BM培养基上继续增殖, 外表无明显变化, 当转移至成熟培养基上后, 增殖变慢, 细丝状结构增粗, 表面变得干燥. 约7天后从愈伤组织表面肉眼可见球形原胚伸出, 14天后原胚不断伸长约0.5 cm左右, 原胚不断增粗, 顶端逐渐变黄, 变硬, 变得光滑(图版Ⅰ-3), 20天后体胚顶端清晰可见子叶形状, 达到前期子叶胚, 此时愈伤组织褐化开始死亡. 30天后发育至子叶胚, 以后胚的形态基本保持不变(图版Ⅰ-4). 体细胞胚转移至萌发培养基上7天后子叶变绿展开(图版Ⅰ-5), 胚根端变为红色, 10天后子叶伸长, 露出粉红色根尖, 14天左右也开始伸长(图版Ⅰ-6), 培养1个月后开始转化为完整植株(图版Ⅰ-7).

对试验数据进行统计分析, 表明3个无性系之间, 每克愈伤组织形成的体细胞胚数差异显著, 体细胞胚的萌发率差异极显著, 但是植株再生率之间差异不显著(表 2). E2胚性系的再生能力最好, 每克胚性愈伤组织形成的体胚数、体胚萌发率、植株再生率均为最高, E3胚性细胞系的再生能力最差, 说明杂种落叶松体细胞胚发生与再生能力受基因型影响(表 2).

2.4 再生植株的移栽

体胚苗移栽后由于较幼嫩, 针叶光合作用和根系的吸收能力较弱, 要经历一段适应期, 容器内必需保持较高的湿度, 否则会蒸腾过度而枯萎. 约1个月左右顶芽开始重新伸出, 体胚苗成活. 本试验共移栽55株成活23株, 成活率为41.8%(图版Ⅰ-8).

3 讨论

本研究首次建立了日本落叶松×长白落叶松和日本落叶松×兴安落叶松2个杂种落叶松体细胞胚发生体系. 本试验选取5个家系进行体细胞胚发生试验, 只有2个家系得到了胚性愈伤组织, 其中日本落叶松5×长白落叶松77-3家系, 4个时期采集的合子胚均诱导出了胚性愈伤组织, 说明杂种落叶松不同家系的体细胞胚发生能力不同, 而日本落叶松5×长白落叶松77-3家系产生的合子胚可能很容易诱导体细胞胚发生. Lelu等(1994b)在试验中发现杂种落叶松的亲本选择对未成熟合子胚胚性愈伤组织的诱导率有明显影响, 当欧洲落叶松267作父本、日本落叶松3016、3026作母本时, 其子代的胚性培养物诱导频率比较高, 当欧洲落叶松139作父本时, 母本不变, 其子代的胚性培养物诱导频率比较低. 同样在北美乔松(Pinus strobus)(Klimaszewska, 2001)、火炬松(P. taeda)(Becwar et al., 1990)、海岸松(P. pinaster)(Lelu et al., 1999)等树种的研究中, 胚性愈伤组织的诱导率均表现出母体效应, 受到采种母树的显著影响. 基于这一现象, 在以后的研究中可以选择容易诱导体细胞胚胎发生的亲本来进行试验.

针叶树种的合子胚是诱导体细胞胚胎发生的最佳材料, 且未成熟胚比成熟胚诱导效果更好. Klimaszewska(1989)认为落叶松合子胚采集时间有一个短暂的窗口期, 授精后2~3周为最佳时期. 在欧日、日欧杂种落叶松(Klimaszewska, 1989; Lelu et al., 1994b)、西方落叶松(Thompson et al., 1992)的胚性愈伤组织诱导中, 前子叶期或子叶胚早期的合子胚诱导率最高. 而Kim等(1999)用未成熟胚进行日本落叶松的体胚发生培养时, 结果则表明子叶胚期的诱导率最高而并非前子叶胚期. 在北美乔松、海岸松、樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)的研究中也表明不同树种的窗口期不同, 但胚性愈伤组织的诱导与合子胚的发育阶段密切相关(Park et al., 2006; Lelu et al., 1999). 本试验中, 各采集时间的合子胚胚性愈伤组织诱导率不同, 可能原因也是杂种落叶松自由授粉后合子胚种子发育时期不一致.

针叶树常用的基本培养基有LP, LM, MS, BM, 为了找到更适宜的基本培养基, 许多学者通过改变大量元素、微量元素、铁盐或维生素等的用量自行设计自行改良, 以最终找到最适宜的基本培养基(Feher et al., 2003). 本试验选用LP, LM, MS, S 4种培养基, 发现在LP培养基上没有诱导出胚性愈伤组织, 在LM培养基上只有7月28日采集的合子胚诱导出了胚性愈伤组织, 在MS和S培养基上, 得到了相对较多的胚性愈伤组织, 说明在选用的几种培养基中, MS和S培养基比较适合于杂种落叶松胚性愈伤组织的诱导.

刚诱导出的胚性愈伤组织的胚性状态还不稳定, 胚性愈伤组织的类型、培养基及其添加植物生长调节剂的变化和继代培养条件合适与否均会影响胚性愈伤组织的维持胚性的潜力, 少数胚性细胞还会丧失胚性, 变为非胚性愈伤组织, 而有的非胚性细胞也会被诱导发生胚性. 本试验中, 不同胚性愈伤组织继代培养一、二代后, 愈伤组织不断增殖, 愈伤组织胚性能够持续保持而不会丧失时, 才可认为是较为稳定的胚性愈伤组织. 在授粉后80~89天采集的合子胚中, 一个外植体上诱导得到2种愈伤组织, 在继代培养的过程中发现非胚性愈伤组织增殖速度比胚性愈伤组织快, 胚性愈伤组织在愈伤团中的比例逐渐减小, 最后整个愈伤组织团全部丧失胚性. 此种原因可能是在继代培养过程中没有及时将2种愈伤及时分离, 或是继代培养的过程中胚性愈伤组织逐渐丧失胚性所致.

本试验通过杂种落叶松未成熟胚成功诱导得到了胚性愈伤组织, 胚性愈伤组织经过体胚诱导、体胚成熟、体胚萌发等步骤, 成功地诱导获得了再生植株, 且移栽成活.