松毛翠(Phyllodoce caerulea)，杜鹃花科(Ericaceae)松毛翠属常绿低矮小灌木，国家三级重点保护植物。《中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)》中定为渐危种，《中国物种红色名录》中定为易危种(汪松等, 2004)。《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定为省级一类重点保护植物，为急需保护植物。其株形矮小优美，枝叶密集，花色粉红色，色泽艳丽，具有较高的观赏价值，可驯化为假山的观赏绿化植物和制作盆景(周繇等, 2005)。因其生于高山冻原和石质山坡，植株耐贫瘠，抗干旱，是水土保持和维持生态平衡的优良植被。松毛翠对研究植物区系也具有十分重要的意义(周繇, 2006)。其分布区域十分狭窄，在长白山区数量稀少，仅集中分布在长白山国家级自然保护区海拔1 800~2 400 m的高山冻原带和岳桦林带下。因其种子不易获得，扦插等常规繁殖成活率几乎为零，开发利用受到极大的限制。因此，在保护好现有野生资源的同时，对这一野生珍贵稀有植物进行离体快繁和试管保存，以防止其灭绝。同时，为缩短培养基配方的摸索周期，应用均匀设计处理和分析数据，以期得到最佳培养条件。与其同科的其他种植物的离体快繁已有报道(宫汝淳等, 2008；顾地周等，2007；2008a)。但松毛翠的离体快繁和种质试管保存在国内外迄今未见。

1 材料与方法 1.1 外植体材料的处理

5月中旬于长白山北坡海拔2 350 m的高山冻原带上采松毛翠休眠枝条在实验室内水培(去除茎尖)促使腋芽萌发。待腋芽萌发并长至1.0 cm时剪下，用75%酒精涮洗60 s，于含5%链霉素的次氯酸钠(0.5%)溶液浸泡10 min，无菌水冲洗8次。用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后作为外植体备用。

1.2 嫩芽基部直接再生芽苗的诱导

以DR为基本培养基，蔗糖20 g·L^-1，琼脂粉9.5 g·L^-1，pH 5.7，温度(26±2) ℃，光强1 600 lx，光照周期12 h·d^-1，附加细胞分裂素TDZ和生长素IAA(由预试验可知浓度范围分别为2.00~4.20 mg·L^-1和0.10~0.30 mg·L^-1。当TDZ的浓度低于2.00 mg·L^-1时嫩茎基部几乎不分化芽苗，超过4.20 mg·L^-1时分化率下降，均在45%以下，说明过高的TDZ浓度对基部直接再生芽苗起抑制作用；当IAA浓度超过0.30 mg·L^-1时嫩芽基部产生愈伤组织，为确保松毛翠经离体快繁后的遗传稳定性，不采取愈伤组织再分化产生芽苗的方式)。为了提高松毛翠再生芽苗的速度和分化率，采用均匀设计法(方开泰，1980)，选用U₁₀(10²)均匀表(表 1)，每个处理接种外植体数为30。考察了TDZ和IAA浓度交叉配比对分化率的影响，同时筛选最适宜的芽苗诱导培养基。

1.3 壮苗及生根

以改良MS(1/4大量元素、1/2微量元素、1/2铁盐和1/4有机成分)为培养基，蔗糖15 g·L^-1，琼脂9.0 g·L^-1，pH 5.7，温度(23±2) ℃，光照强度1 000 lx，光照周期8 h·d^-1。附加不同浓度的IAA、IBA和NAA，同时加入KT0.1 mg·L^-1(壮苗)，由单一因子试验可知：3种生长素浓度分别控制在0.10~0.20 mg·L^-1、0.05~0.15 mg·L^-1、0.01~0.03 mg·L^-1。高浓度的3种生长素(超过控制范围的最高浓度单一使用或在范围内的最高浓度的任意2种)均导致幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤，继续培养根从膨胀部或愈伤瘤上发出，这样的苗在移栽时根随愈伤瘤从苗基部脱落，移栽成活率几乎为零，可能是根与苗茎的纤维疏导组织连接不完整所致。在培养基中附加KT0.1 mg·L^-1生根苗较未附加的粗壮。采用低于控制范围的最低浓度单一生长素或任意2种或3种同时加入的培养基中进行60天的培养，生根率均在58%以下。因此，为了提高松毛翠的生根率，采用均匀设计法，每个处理接种苗数为50，选用U₁₀(10³)均匀表(表 2)，同时考察IAA、IBA和NAA浓度交叉配比对生根率的影响，筛选最适合松毛翠组培苗生根的培养基。

1.4 再生植株快繁体系的建立

采用节培法进行快繁(顾地周等，2008b；2008c)，将生根的苗切割成小段转接到优化后的培养基中，同时进行腋芽萌发、伸长及生根培养。统计并计算出增殖周期和倍数。

1.5 种质试管保存

以N-68为基本培养基，蔗糖30 g·L^-1，温度为(20±2) ℃，光照强度800 lx，光周期8 h·d^-1，并附加不同浓度的矮壮素B₉和生长延缓剂根皮苷对基部含有芽锥的小芽团进行试管保存。由预试验可知，B₉浓度控制在1.20~2.30 mg·L^-1之间，超过2.30 mg·L^-1时小芽团上的芽苗出现缩节现象，低于1.20 mg·L^-1时苗趋于明显生长趋势。根皮苷浓度控制在0.50~1.50 mg·L^-1之间，超过1.50 mg·L^-1时芽苗很快变黄最终枯萎，低于0.5 mg·L^-1保存4个月以后恢复生长。矮壮素B₉和生长延缓剂根皮苷超过最大浓度同时加入时，尽管松毛翠试管苗生长率达0.8%以下，但苗在12个月的保存过程中形态发生变化且逐渐变黄枯萎直至死亡。为了摸索松毛翠试管保存时矮壮素B₉及根皮苷浓度的最佳配比和降低生长率，采用均匀设计法，每个处理数为50瓶，选用U₁₂(12²)均匀表(表 3)，同时考察矮壮素B₉和根皮苷的浓度交叉配比对生长率的影响，筛选最适合种质试管保存的培养基。

1.6 数据分析

数据分析与处理采用均匀设计(Uniform Design)软件。

2 结果与分析 2.1 DR培养基中不同浓度TDZ和IAA配比对松毛翠嫩茎基部直接再生芽苗的影响

试验所得数据(表 4)经均匀设计软件分析处理后(表 7)可知，回归方程显著。根据回归方程求出Y的最优组合为：X₁=4.20；在此组合基础上求得最优解：y=93.9，此解为回归方程的解析解，需按公式Y=y±u_αs计算出优化值区间估计为Y= 93.9(±8.18)，即85.72%~102.08%。试验结果发现，当TDZ的浓度低于2.00 mg·L^-1嫩芽基部几乎不分化芽苗，超过4.00 mg·L^-1时诱导率下降(说明过高的TDZ浓度对基部直接再生芽苗起抑制作用)，并且诱导产生的芽苗较细弱。因此，以优化值TDZ 4.00 mg·L^-1进行验证试验(重复数为30瓶)。嫩芽接种到附加TDZ 4.00 mg·L^-1的DR培养基上，培养45天，发现基部产生大量锥形突起，继续培养至60天锥形突起伸长为芽苗(图 1a)；培养至75天再生芽苗可伸长至2.0 cm以上，且苗壮而整齐，分化率达98.5%以上，在估计区间范围内，且比所有试验Y值都大。因此，松毛翠嫩芽基部直接再生芽苗的最佳诱导培养基为：DR+TDZ 4.00 mg·L^-1。

2.2 改良MS培养基中不同浓度生长素配比对松毛翠组培苗生根的影响

试验所得数据(表 5)经均匀设计软件分析处理后(表 7)可知，回归方程显著。根据回归方程求出Y的最优组合：X₂=0.05，X₃=0.01；在此组合基础上求得最优解：y=97.2，按公式Y=y±u_αs计算出优化值区间估计为Y=97.2(±0.861)，即96.339%~98.061%。以最优组合做验证试验，待嫩芽基部再生的芽苗长至1.0 cm以上时，将生长健壮的苗切下，然后将其移入附加IBA0.05 mg·L^-1 +NAA0.01 mg·L^-1 +KT0.10 mg·L^-1的改良MS培养基中，培养35天幼苗基部开始产生根锥，45天后幼苗基部直接发出3~5条不定根(图 1b)，有的产生了侧根，苗高可达1.5 cm以上，根和苗的形态、发育均正常，生根率达97.8%。在估计区间范围内，且比所有试验Y值都大。可见，松毛翠最佳生根培养基为：MS(改良)+ IBA0.05 mg·L^-1+NAA0.01 mg·L^-1+KT0.10 mg·L^-1。

2.3 再生植株快繁体系的建立

因考虑到嫩茎基部直接分化的芽苗较细弱，剪取生根时可操作性较难和遗传稳定性等因素，采取节培法进行植株增殖，待生根的苗伸长至2.0 cm以上时，在超净工作台上打开培养瓶留2~3针叶剪下苗干，将其切割成小段转接到附加3.50 mg·L^-1GA₃(有利于茎段腋芽的迅速萌发和伸长)的生根培养基中，同时进行节伸长及生根培养(图 1c)。40天为1个增殖周期，每瓶增殖倍数平均达35倍以上。随着增殖次数的增加可适当降低生长素浓度(以免激素积累)。因此，松毛翠再生植株增殖培养基为MS(改良)+IBA0.05 mg·L^-1 +NAA0.01 mg·L^-1 +KT0.10 mg·L^-1 +GA₃3.50 mg·L^-1。

2.4 炼苗和移栽

待生根苗长至2.0 cm时，从培养瓶中取出，在含有3 mg·L^-1杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经20倍杀毒矾消毒过的泥炭土和细河砂(4:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在(18±2) ℃，每天自然光照8 h，每天中午通风换气10 min，10天后揭去薄膜，每天早晚喷洒清水各1次。成活率达98%以上(图 1d)。

2.5 N-68培养基中不同浓度B₉及根皮苷的交叉配比对松毛翠种质试管保存的影响

试验所得数据(表 6)经均匀设计软件分析处理后(表 7)可知，回归方程显著。根据研究目的(反向优化)和回归方程求出Y的最优组合为：X₁=2.3，X₂=1.5，将其代入方程，求得y=1.31，按公式Y=y±u_αs计算出优化值区间估计为Y=0.854(±2.45e^-2)，即0.829 5~0.878 5。以优化值B₉2.30 mg·L^-1+根皮苷1.50 mg·L^-1进行验证试验，结果表明：将小芽团接种到附加B₉ 2.30 mg·L^-1和根皮苷1.50 mg·L^-1的N-68培养基上进行保存，保存12个月小芽团上的芽苗平均生长率仅为0.832%，继续保存至42个月后，测其平均生长率为0.85%以下，在估计区间范围内，且比所有试验Y值都小。因此，松毛翠小芽团的最佳试管保存培养基为：N-68+B₉2.30 mg·L^-1+根皮苷1.50 mg·L^-1。采用此培养基，在常温条件下，保存时间长达42个月以上，芽苗的形态、质量等均无明显变化(图 1e)。

经42个月的保存后，将小芽团转接到嫩芽基部直接再生芽苗培养基DR + TDZ 4.00 mg·L^-1上进行解除保存培养，培养40天后，芽苗叶片由浅绿逐渐转为翠绿色，继续培养至65天，回复迅速生长状态，小芽团上的芽锥继续生长并伸长为苗，诱导率达100%，且苗粗壮、生长旺盛，形态和发育均未出现异常(图 1f)。对保存后基部再生的芽苗进行生根试验发现，培养25天在苗基部和茎部均产生根锥，40天后根长可达1.0 cm以上，比未保存前的生根速度快，且生根率达99%以上。

3 讨论与结论

试验证明，培养基DR+TDZ 4.00 mg·L^-1对松毛翠嫩芽基部直接再生芽苗的诱导效果最好，松毛翠离体培养采取新生嫩芽基部直接再生方式，遗传稳定性好，速度快、分化率高。培养基MS(改良)+IBA0.05 mg·L^-1+NAA0.01 mg·L^-1+KT0.10 mg·L^-1较适合于松毛翠的生根，在培养基中附加0.10 mg·L^-1的KT，再生植株较未附加的粗壮且长势好。再生植株快繁采取节培法，在生根培养基的基础上进行优化，附加3.50 mg·L^-1的GA₃有利于茎段腋芽的迅速萌发和伸长，从而缩短了增殖周期，提高了增殖倍数。方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了再生植株快繁的目标。目前，国内外已有很多关于植物种质保存方面的报道，大多采取低温处理、玻璃化、包埋、低温结合弱光照等方法(钱剑林等，2004；Shawky，2007；Acedo et al., 2005；Carini et al., 2001)。本研究对松毛翠的种质保存采取“矮化延缓生长”的方法(艾鹏飞等，2004；顾地周等，2008d)，在N-68培养基中不需加入生长素和细胞分裂素，只需加入矮壮素B₉2.30 mg·L^-1和根皮苷1.50 mg·L^-1对含有少量芽锥的小芽团进行试管保存，这种方法可在常温下保存松毛翠种质达42个月以上。通过对解除保存的小芽团进行培养和生根试验证明：解除保存后小芽团很快回复生长，芽锥能很快生长伸长成苗且生长旺盛，形态和发育均未出现异常，苗的生根速度和生根率也较保存前快而高。应用均匀设计法处理和分析数据大大缩短了培养基配方的摸索周期。本研究结果证明：已成功建立了松毛翠高效离体快繁体系，达到了种质试管保存目的。本文结果对长白山区松毛翠的开发利用、工厂化育苗和种质试管保存有一定的参考意义。