紫杉醇(taxol)是最具抗癌活性的天然化合物(Crag et al., 1993),现已被40多个国家用于多种癌症的治疗.迄今为止,人工培育红豆杉属(Taxus)植物仍然是获取紫杉醇最为有效、可行的途径(苏建荣等,2005a;王伟昌等,2006).因此,红豆杉属植物的良种选育研究一直深受重视.程广有等(2005)探讨了东北红豆杉(T. cuspidata)树皮紫杉醇含量的变异规律;程克棣等(1998)对东北红豆杉RAPD扩增条带的比较研究发现,紫杉醇高含量植株与低含量植株存在着明显的条带差异;陈毓亨等(1999)利用PAPD技术对南方红豆杉(T. chinensis var. mairei)的研究表明,高含量植株不同程度地从地区中分化出来,形成了自己的分子带谱特征.这些研究仅测定了树皮的紫杉醇含量,而收获枝、叶对树体破坏轻,所以枝、叶紫杉醇含量变异的研究对于探究红豆杉属植物的栽培模式尤为重要.

云南红豆杉(T. yunnanensis)主要分布于我国的滇西、滇西北、滇西南、滇中、川西、藏东南等地的13个地(州、市)(苏建荣等,2005b),因分布广、资源相对丰富(陈振峰等,2002)而成为紫杉醇生产的主要树种,广泛用于滇、川、渝、藏等地的药用原料林基地建设.云南红豆杉药用原料林培育技术研究主要集中在种苗培育、采穗圃营建、人工林营建及紫杉醇含量分析等方面(王卫斌等,2007).在云南红豆杉药用成分含量变异方面,苏建荣等(2005a;2006)比较了10个龄级和12个地理种源的树皮、小枝和叶的紫杉醇含量;分析了紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、10-去乙酰-7-表紫杉醇等药用成分的含量及其相互间的关系,但是因研究的样本数少而未能揭示紫杉醇含量变异的规律.关于与云南红豆杉紫杉醇含量变异及其相关联分子标记的研究尚未见报道.

云南红豆杉的世代周期长、杂合度高、树体高大,常规育种技术对紫杉醇含量的选育效果不显著、周期较长、成本较高(王达明等,2007).由于能够缩短选育周期、降低选育成本、提高选育效率,分子标记辅助选择(MAS)的应用越来越广泛(黄永芳等,2006;赵静等,2006;张虎平等,2005;苏晓华等,2000).鉴于此,本研究通过系统采样探讨云南红豆杉不同器官的紫杉醇含量的变异规律,通过RAPD标记与不同器官紫杉醇含量性状的关联分析,筛选相关的RAPD分子标记,以期为云南红豆杉的优良单株和优良种源筛选积累基础资料,并为开发快速、便捷、低成本、不毁坏和损伤植株的指示紫杉醇含量的标记奠定基础,从而推动云南红豆杉原料林培育的良种化进程,促进高产紫杉醇原料的发展.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料来源

试验材料于2006年2月采自云南、四川的5个云南红豆杉天然群体,取样地的地理位置以及气候条件见表 1.

1.1.2 取样方法

云南红豆杉树皮、小枝和叶的紫杉醇含量差异显著,且受树龄和取样部分的影响很大(苏建荣,2005a).故采用统一的取样标准,分树皮、小枝和针叶3个层次取样.云南红豆杉的胸径与年龄具有良好的相关性,采样时通过胸径控制树龄(苏建荣,2006).采样时,从5个群体中各选取10株生长健壮、胸径25 cm的样株,从每样株上采集树皮、3年生小枝和1年生针叶样用于紫杉醇含量的测定.树皮样在主干上距离地面1.2 m处剥取,大小为20 cm×30 cm;在树冠中部向阳面采摘3年生小枝和1年生针叶各500 g.鲜样置于室内干燥、通风处阴干后备用,阴干过程免阳光照晒.同时,采集各样株的嫩叶用变色硅胶快速干燥,带回实验室保存,用于RAPD分析.

1.2 试验方法 1.2.1 紫杉醇测定

采用高效液相色谱(HPLC)测定树皮、小枝和针叶样品中的紫杉醇含量.测定方法参见苏建荣等(2005a).

1.2.2 RAPD分析

采用CTAB微量法(王关林等,1998)提取基因组DNA.从90条10 bp的随机引物(上海博亚生物技术公司)中筛选出23条能获得清晰且可重复条带的引物用于扩增.在PTC200 PCR仪(MJR公司,美国)上进行RAPD-PCR扩增.采用20 μL的反应体系,包含1.75 mmol·L^-1的MgCl₂、10×buffer(100 mmol·L^-1 KCl,80 mmol·L^-1 (NH₄)₂SO₄, 100 mmol·L^-1 Tris-HCl,pH 9.0,0.5% NP-40) 2 μL、250 μmol·L^-1的dNTP、引物60 ng、Taq DNA聚合酶1 U、模板DNA 30 ng,Taq DNA聚合酶、MgCl₂、10×buffer和dNTP购自上海Promega公司.扩增程序为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 2 min、36 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,40个循环;72 ℃ 7 min,4 ℃下保存.扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,0.05%的溴化乙啶染色,GONGDS8000(UVP公司)凝胶成像系统照相,用100 bp的DNA ladder作为参照,估计DNA片段的分子质量大小.手工记录每个植株的RAPD指纹图谱,若出现条带记为1,否则记为0,构建(0,1)矩阵.

1.3 数据分析 1.3.1 紫杉醇含量变异的分析

使用SAS9.0软件对群体的树皮、3年生小枝和1年生针叶的紫杉醇含量进行描述统计,采用方差分析检验紫杉醇含量的群体间差异,用巢式方差分析检验群体间紫杉醇含量的差异显著性,分析紫杉醇含量变异程度在群体间和群体内的分布(陈小兰等,2004).

1.3.2 RAPD标记与紫杉醇含量的关联分析

根据(0,1)矩阵,按各位点依次把所有个体划分为有带和无带2个亚群体,应用SPSS13.0软件中的单因素方差分析和相关分析程序,分析RAPD标记与树皮、小枝和叶紫杉醇含量变异的相关性.用组间方差与总方差的比值求得该标记产生的性状变异占性状总变异的百分率,即位点对该性状变异的贡献率(苏晓华等,2000).

1.3.3 与紫杉醇含量相关的特异性RAPD带谱分析

以所有树皮样本中紫杉醇含量最大值的20%为间距,将所有样株按其树皮紫杉醇含量由低到高划分成5类,记为Pop1, Pop2, Pop3, Pop4和Pop5;结合(0,1)矩阵,采用GenAlEx 6.1软件(Peakall et al., 2006)的Frequency程序进行特异性带谱的分析.采用相同的方法进行小枝和针叶的特异性带谱分析.

2 结果与分析 2.1 云南红豆杉的紫杉醇含量变异

由所有个体构成的总群体中,树皮、小枝和针叶的紫杉醇含量分别为116.12,12.369,38.778 μg·g^-1(表 2).方差分析和Duncan多重比较表明,树皮、小枝、针叶两两间的紫杉醇含量差异极显著(P＜0.01).相关分析表明,树皮与小枝、针叶的紫杉醇含量相关不显著(P>0.05),小枝与叶的紫杉醇含量相关极显著(P＜0.01).

表 2表明,树皮、小枝及针叶的紫杉醇含量在5个群体间存在差异.方差分析表明,树皮紫杉醇含量群体间的差异达显著水平(F_树皮＝2.935^*),小枝和针叶紫杉醇含量在群体间的差异极显著(F_小枝＝6.129^**,F_针叶＝9.452^**).

巢式方差分析(表 3)也表明,树皮紫杉醇含量的总变异中群体间的变异占16.22%,个体间的变异83.78%;小枝紫杉醇含量群体间的变异占33.9%,个体间的变异占66.10%;针叶紫杉醇含量群体间的变异占45.81%,个体间的变异占54.20%.云南红豆杉树皮和小枝紫杉醇含量的变异主要分布在群体间,而叶紫杉醇含量变异在群体间和个体间的分布基本接近.云南红豆杉和东北红豆杉树皮紫杉醇含量的变异具有相同的分布式样,东北红豆杉树皮紫杉醇含量变异在群体间和个体组成分别为84.6%和15%(程广有等,2005).

2.2 RAPD标记与树皮紫杉醇含量的关联分析

应用23条引物从5个群体50个植株中共扩增出194条多态条带.方差分析表明,在194个RAPD标记位点中共检测出11个位点与树皮紫杉醇含量相关联,相关系数为0.279~0.339,其中7个位点起正效应,4个位点是负效应.相关联位点的贡献率在7.791%~11.509%,贡献率最大的位点是S1-1(表 4).

2.3 RAPD标记与小枝紫杉醇含量的关联分析

从表 5可知,共检测出13个与小枝紫杉醇含量相关联的RAPD位点,其相关系数为0.280~0.495.这些位点中8个起正效应,5个起负效应.与小枝紫杉醇含量相关联位点的贡献率为7.853%~24.457%,其中S8-6,S41-6和S77-1位点的贡献率在16.317%以上,并且以S77-1位点的贡献率最大.

2.4 RAPD标记与针叶紫杉醇含量的关联分析

与云南红豆杉树皮和小枝相比,与叶紫杉醇含量关联的RAPD标记位点明显增多.在194个位点中,共检测出59个位点与叶紫杉醇含量关联,其中39个达到极显著水平(P＜0.001).相关联位点中,有36个位点表现出正效应,23个位点呈负效应.与叶紫杉醇含量关联位点的贡献率为7.858%~26.729%,其中22个位点的贡献率大于20%(表 6),贡献率在10%~20%间的位点共26个,另外10个位点的贡献率在10%以下.位点S4-1,S10-8,S13-1和S66-1同时控制着树皮紫杉醇含量的变异;位点S31-1,S41-5,S41-6,S77-1和S77-3同时控制着小枝紫杉醇含量的变异,且位点S41-6和S77-1对小枝和叶紫杉醇含量变异的贡献率均达到20%以上.

2.5 与紫杉醇含量相关的特异性RAPD标记

筛选出指示树皮、小枝、针叶紫杉醇低含量的RAPD特异性条带分别为4条、2条和5条;指示树皮和针叶紫杉醇次低含量的特异性条带各1条(表 7).与陈毓亨等(1999)的研究结果不同,本研究未筛选出指示紫杉醇高含量的特异性RAPD标记.

3 结论与讨论

云南红豆杉的资源多、分布广,遗传变异和育种资源十分丰富(王卫斌等,2007).地理种源变异和个体变异样式在林木遗传改良中具有重要的意义,云南红豆杉的遗传改良策略应根据不同器官紫杉醇含量的变异分布特点结合培育目标制订.本研究表明,云南红豆杉不同器官紫杉醇含量变异分布式样差异很大,树皮、小枝和针叶中紫杉醇含量在个体间的变异分别占总变异的83.78%,66.10%和54.20%.因此,云南红豆杉良种选育研究中应分树皮、枝、叶3个层次进行,以满足不同生产目的的需要.以获取树皮为目标的选育应侧重优良个体的选择;以收获小枝、叶为目标的选育则应在种源选择的基础上开展优良个体的筛选.

本研究分别筛选出与云南红豆杉树皮、小枝和针叶紫杉醇含量相关联的位点11个、13个和59个,调控树皮、小枝和针叶紫杉醇含量的基因数量递增.采用免疫细胞化学定位技术(immunocytochemical localization)研究表明,紫杉醇在针叶中合成,经小枝输送到树皮和根皮中贮存(Russin et al., 1995),针叶和树皮分别是紫杉醇代谢的“源”和“库”.“源”、“库”关系可能是云南红豆杉不同器官中调控紫杉醇含量的基因数量产生差异的原因.紫杉醇的生物合成较复杂,需要大量的关键酶和基因参与合成调控(Eisenreich et al., 1996).由于基因数量越多越易受到环境的影响(阎秀峰等,2007),所以可以推测环境条件对针叶、小枝和树皮的影响程度可能依次减小.在药用原料林的资源培育研究中应注意是否有该现象发生,以便采取适宜栽培措施以提高药用原料林的目标器官的紫杉醇含量.

本研究筛选的与云南红豆杉树皮、小枝和针叶紫杉醇含量相关联位点的贡献率分别为7.791%~11.509%,7.853%~24.457%和7.858%~26.729%.部分位点同时控制着不同器官的紫杉醇含量,比如S41-6和S77-1同时控制着针叶和小枝中的紫杉醇含量,且贡献率均在20%以上.可见,既有稳定表达的共同基因,也有各自特有的基因参与调控不同器官的紫杉醇含量,表明控制同一性状的同类基因具有不同的时空表达.另一方面,部分位点的贡献率较大,比如S1-1对树皮紫杉醇含量的贡献率达11.509%;S77-1,S41-6对小枝紫杉醇含量的贡献率高达20%以上;S11-4,S41-6,S77-10对针叶紫杉醇含量的贡献率大于24%.在遗传育种中,如果合理利用同时调控多个器官紫杉醇含量和对各器官紫杉醇含量贡献率较大的位点,对提高树皮、小枝和针叶的紫杉醇含量具有一定的作用.本研究还筛选出了多条指示低含量紫杉醇的特异性RAPD带谱,利用它们可缩小高含量紫杉醇植株的筛选范围,减少筛选成本和工作量,具有一定的生产意义.在今后的研究中,应加强筛选与紫杉醇含量相关的位点,尤其是获得与云南红豆杉紫杉醇高含量相关联的特异性位点.