铁皮石斛(Dendrobium candidum)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)的草本植物, 是我国传统名贵的中药材, 是石斛药材中的上品。久经长期拔采药用, 野生资源已濒临枯竭。1992年被我国"红皮书"列为濒危植物, 受国家一级重点保护(傅立国等, 1992)。为了保护与发展石斛资源, 同时满足人类的需求药用, 人工栽培石斛是唯一出路。研究菌根化石斛组培苗吸收、积累N素营养规律, 对揭示石斛人工栽培营养机理具有重要意义。

铁皮石斛气生根与真菌共生形成内生型的"兰科菌根", 它依赖其菌根吸收水分和营养, 供其正常生长与发育。石斛的菌根与其他内生型菌根(AM菌根、杜鹃类菌根)比较, 不仅侵染的真菌种类与结构不同, 而且石斛菌根是附生于疏水岩石和树皮上, 属于菌根气生型。它既有吸收、固定和保护的功能, 又含有叶绿素进行光合作用而自养, 与地生植物菌根比较, 其菌根功能更优越和独特(弓明钦等, 2000;陈连庆等, 2002a; 2002b)。石斛气生菌根除从空气雾水和降雨中, 能获得少量的营养外, 主要通过菌根根外菌丝对周边的枯木或残存有机物, 进行分解与吸收, 并通过菌丝桥网络与根细胞构建通道, 传递各种营养和水分, 供石斛生长与发育之所需。N素是体细胞、活性物质和酶类等有机物质的基础组成成分, 是所有植物生长的必需营养元素(弓明钦等, 2000;陈连庆等, 2002a; 2002b)。有关外生菌根和AM菌根对N素利用的机理研究, 已取得了许多进展, 但对于石斛气生菌根与N素关系的基础理论研究鲜有涉及(Kramer et al., 1985; Simard, 1997; Wright et al., 1998;张美庆等, 1998;陈连庆等, 2005)。本试验以附生石斛为材料, 应用生物技术克隆菌根, 进行N源及其不同浓度的试验, 揭示石斛菌根对N营养吸收利用的效果, 现报道如下。

1 材料与方法 1.1 材料

试验采用浙江省富阳市高山峭壁生长的铁皮石斛, 经组织培养以及接种优良菌根真菌(菌根真菌编号为F9903菌株), 人工合成石斛菌根。选生长一致的石斛菌根化组培苗(苗高0.6 cm、茎粗0.79 mm、烘干质量0.006 5 g)为原始试验材料, 用于不同试验处理。

1.2 方法 1.2.1 石斛菌根苗不同

N源试验在无N源的基础培养基(KC培养基去除N化合物)中, 加入不同的无机和有机N化合物(各N化合物同含纯N 360.7 mg·L^-1): ①硝酸钙、②硫酸铵、③硝酸钾、④磷酸二氢铵、⑤尿素、⑥甘氨酸、⑦酒石酸铵、⑧谷氨酸、⑨CK, 共9个处理, 每处理10次重复(瓶内培养基体积50 mL)。灭菌后, 植入菌根化的石斛组培苗(每瓶3株), 容器为高分子PC塑料瓶, 置于LRH-250-G光照培养箱[ (25 ± 0.5 ℃、光照1 500 lx、90 d]无干扰培养。

1.2.2 共生菌根真菌(F9903)不同

N源试验在无N源的基础培养基中(同上), 加入不同N源(同上): ①硝酸钙、②硫酸铵、③硝酸钾、④磷酸二氢铵、⑤尿素、⑥甘氨酸、⑦酒石酸铵、⑧谷氨酸、⑨CK, 9个处理。在250 mL三角瓶内放入50 mL不同N源培养液, 每处理重复3次。灭菌后每瓶接种等量、活力旺盛的菌根真菌菌丝体(菌丝体烘干质量1 mg), 培养液pH值为7, 在温度(30 ±0.5)℃条件下, 进行振荡与间歇增殖培养(培养周期8 d)。

1.2.3 石斛菌根苗不同浓度

N素试验取无N源的基础培养液(同上), 分别加入酒石酸铵(最佳N源), 处理浓度是0(CK)、2.72、5.43、10.86、16.29、21.72、32.58、43.44、54.3 mmol·L^-1共9个处理, 每处理重复10次。每瓶移入菌根化组培苗3株(瓶内培养基体积50 mL), 培养条件同石斛菌根苗不同N源试验。

1.2.4 菌丝体生物量测定

从各处理三角瓶内, 取出含菌丝的培养液, 经抽提→过滤→无菌水冲洗→ 105 ℃烘干至恒质量, 获得菌丝体生物量。

1.2.5 测定方法

全N分析应用开氏定氮法, 全P测定采用钼锑抗比色法, 有机C用重铬酸钾法进行分析。

2 结果与分析 2.1 菌根化石斛组培苗吸收利用N源的效应 2.1.1 不同N源促进菌根化石斛组培苗生长的效果

菌根化石斛组培苗在生长过程中, 因不同N源所提供可溶性N素营养的差异, 使石斛生长显现不同结果。图 1表明: N源酒石酸铵(处理7)对石斛菌根化组培苗的高生长和茎粗促进作用最明显, 均为最大值(苗高2.12 cm、茎粗1.83 mm)。与对照(处理9, 苗高0.68 cm、茎粗1.0 mm)相比较, 分别提高211.76 %和83.0 %。与处理4(效果差的磷酸二氢铵, 苗高1.33 cm、茎粗1.15 mm)相比较, 分别提高59.4 %、59.13 %。

2.1.2 不同N源对菌根化石斛组培苗鲜、干质量的效应

图 2表明: N源酒石酸铵(处理7)对石斛菌根化组培苗的鲜质量和干质量的积累也为最大值(0.297 g、0.046 9 g), 与对照(处理9 :鲜=0.098 g、干= 0.009 3 g)相比较, 分别提高203.1 %和404.3 %。处理7苗高与其他处理相比较差异明显, 所以综合以上效果, 确定酒石酸铵为菌根化石斛组培苗增殖培养的最佳N源。

2.2 共生菌根真菌(F9903)增殖培养与不同N源的关系

F9903菌株对提供的8种不同N源, 吸收利用的程度不同。从图 3看出, F9903菌株对有机N源利用效果较好, 尤以酒石酸铵N源利用效果最佳, 菌丝体增殖的干质量为1.531 mg·mL^-1, 与接种量(0.01 mg·mL^-1)菌丝体干质量相比较提高了153.1倍。对不同N源利用效果(干质量)进行排序:酒石酸铵>甘氨酸>尿素>硫酸铵>谷氨酸>磷酸二氢铵>硝酸钾>硝酸钙>CK (处理9)。对照(处理9)无N源, F9903菌株菌丝体几乎没有增殖生长, 无N素营养来源, 氨基酸、蛋白质和核酸等都不能合成, 致使菌丝体细胞停止分裂生长。F9903菌株对无机N源利用效果相对较差, 尤其对硝态N源的利用率更差, 使菌丝体增殖量偏小。

将菌根化石斛组培苗的干质量柱状图与F9903菌根真菌菌丝体干质量柱状图相比较(图 4), 表现出效果图形相似, 最佳N源基本重合在处理7(酒石酸铵)上, 增殖干质量均为最大值; 无N源的CK(处理9), 显示出干质量增殖最小。这进一步说明, 石斛菌根与菌根真菌密切共生的互动关系, 并耦合于酒石酸铵提供的最适宜N源。但有无N素营养又是决定石斛能否正常生长发育的必要因素之一。

2.3 酒石酸铵不同浓度对石斛菌根化组培苗的作用 2.3-1 酒石酸铵不同浓度促进菌根化石斛组培苗生长的反应

在不同浓度下, 菌根化石斛组培苗生长反应显示出明显的差异。生物统计分析结果表明(表 1):酒石酸铵不同浓度生长效应的显著性概率均达到0.01水平, 这说明苗高、茎粗、蘖数、根数、根长、叶数、鲜质量、干质量等指标的差异均显示为极显著。

通过LSD法多重比较以及图 5、6结果表明:不同酒石酸铵浓度处理对石斛苗高、茎粗、蘖数、根数、根长、叶数、鲜质量和干质量产生不同影响, 处理2(酒石酸铵2.72 mmol·L^-1)增长效果均显示最高水平, 如:每株平均苗高为3.27 cm, 干质量为0.039 g, 分别是处理1(CK苗高= 2.06 cm、干质量=0.014 g)的1.59和2.79倍。处理2(苗高)与处理1、4、5、6、7、8、9差异极显著, 与处理3差异显著; 处理2(干质量)与处理1、3、4、5、6、7、8、9差异极显著。这说明不同浓度的酒石酸铵, 对促进菌根化石斛组培苗生长的效果存有不同差异。图 5、6还清楚地显示, 处理2以后随着酒石酸铵浓度的成倍递加, 石斛苗生长和鲜、干质量的累积呈现不断下降的趋势, 浓度越高增长量越小。

2.3.2 酒石酸铵不同浓度处理的菌根化石斛苗对C、N、P营养元素的吸收与积累

图 7表明:在相同培养周期内, 处理2(2.72 mmol·L^-1酒石酸铵)对菌根化石斛组培苗吸收、积累C素营养的水平最高, 达667.7 g·kg^-1, 是处理1(CK 336.8 g·kg^-1)的1.98倍; 处理2(2.72 mmol·L^-1酒石酸铵)的菌根化石斛对N素营养吸收、积累水平也是最高, 达60.5 g·kg^-1, 是处理1(CK 21.2 g·kg^-1)的2.85倍; 对P素营养吸收、积累水平还是处理2(2.72 mmol·L^-1酒石酸铵)最高, 达5.756 g·kg^-1, 是处理1(CK 2.346 g·kg^-1)的2.46倍。图 7还显示:从无酒石酸铵N源(处理1)开始, 随着培养基含N浓度的增加, 石斛吸收、积累C、N、P营养元素的数量会相应增加, 直至达到最大值(处理2)。但处理3以后, 不断加倍提高酒石酸铵浓度, 虽然提供了充足的N素营养, 反而影响了石斛对C、N、P营养元素的吸收与积累。这可能是因为石斛菌根对不同浓度的酒石酸铵利用效率和培养基渗透压的大小以及营养比例失调相关, 其机理有待进一步深入研究。同时, 还显示出无N营养条件下, 石斛会因N饥饿胁迫而停止生长或自耗衰败。这充分说明N元素是石斛生长发育必不可少的重要营养元素。浓度遴选试验结果:菌根化石斛组培苗对C、N、P营养元素吸收、积累最适宜浓度为酒石酸铵2.72 mmol·L^-1(处理2)。综上所述, 在酒石酸铵最佳N浓度下, 石斛菌根不仅促进了石斛组培苗的生长和干质量的累积, 而且对C、N、P的吸收、积累水平也是最高。

3 结论与讨论

1) 濒危珍贵的铁皮石斛, 属于"兰科菌根"类型, 是依赖"菌根"从环境中吸收利用多种养分与水分, 维持其正常生长和发育的典型物种。本研究揭示菌根化石斛对N素营养的生理反应, 进一步阐明不同N源与浓度对其生长和C、N、P元素吸收、积累的关系。

2) N源试验显示出, 菌根化石斛组培苗对有机酒石酸铵提供的N源效果最敏感, 在促进生长、鲜、干质量等增殖多项指标上, 都显示出最高水平, 是培育菌根化石斛组培苗的理想N源。

3) 不同N源对石斛菌根真菌(F9903菌株)增殖效果的图示表明, F9903菌株对酒石酸铵N源利用效果最佳, 菌丝体增殖量最高, 与菌根化石斛组培苗对酒石酸铵提供的N源试验相比较, 其效果相同。菌根化石斛组培苗的干质量积累柱状图与共生菌F9903菌根真菌菌丝体干质量增殖柱状图相比较, 表现出图形趋势相似, 具有良好的相叠性。这进一步证明石斛对N素的吸收、积累与共生菌根真菌互动关系密切, 也显示出石斛菌根的高效功能。这对保护、扩繁与人工栽培濒危石斛具有重要意义。

4) 最佳N源酒石酸铵不同浓度对石斛菌根化组培苗的效应表明, 不同浓度处理对石斛苗高、茎粗、蘖数、根数、根长、叶数、鲜质量和干质量都产生明显的影响, 处理2(2.72 mmol·L^-1酒石酸铵)各增长效果均显示极显著性差异; 菌根化石斛对吸收利用与积累N、C、P元素能力也产生明显影响, 处理2(2.72 mmol·L^-1)效果最佳, 这充分说明处理2(2.72 mmol·L^-1)是最适宜石斛菌根化组培苗生长的浓度。同时反映出, 石斛在无N营养条件下, 虽有适量C、P等营养, 而N饥饿胁迫使其停止生长至自耗而衰败, 所以N是必不可少的重要营养元素。