杨属(Populus)包括白杨派(Leuce)、黑杨派(Aigeiros)、青杨派(Tacamahaca)、胡杨派(Turanga)和大叶杨派(Leucoides)，有100余个种，杨属派间、种间存在广泛遗传变异。以往研究杨属派间、种间变异，主要根据形态标记，即杨树的外部形态特征，如树高、胸径、分枝、冠形、叶形、芽形、花形、果形、叶背绒毛、叶缘锯齿等(徐纬英，1988)，但是，形态标记数量有限、多态性差、易受环境影响等。随着分子生物学技术的发展，出现了多种分子标记技术，使从基因组水平探讨杨属派间、种间及无性系间遗传变异成为可能(张德强等，2001；张志毅等，2002)。与形态标记相比，分子标记具有如下优点:直接以DNA形式表现，在植物的各个组织、器官以及不同发育时期均可检测到，不受季节、环境条件的影响，不存在表达问题；数量多，遍及整个基因组；多态性高；表现中性；有许多分子标记表现为共显性，能够鉴定出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息等。因此，分子标记被认为是进行遗传变异评价的理想标记(邹喻苹等，2001)。目前，广泛应用的分子标记主要有：RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，其中AFLP法集RFLP与RAPD 2种方法的优点于一体，而且能提供比RFLP和RAPD更多的基因组多态性信息(Mukherjee et al., 2003；Faouzi et al., 2003)，AFLP已成功地应用于杨属种质鉴定和基因图谱的建立(Bradshaw et al., 1995)。李宽钰等(1996)应用RAPD标记对杨属白杨派、青杨派、黑杨派的20个种的28个无性系研究表明，3个派明显独立，且青杨派与黑杨派关系较近，而与白杨派则相对较远。苏晓华等(1996)对青杨派的甜杨(P. suaveolens)、大青杨(P. ussuriensis)、香杨(P. koreana)和马氏杨(P. maximowiczii)的80个无性系进行RAPD分析，每个树种的全部无性系聚为一类，分子水平分类结果与经典分类一致，大青杨与香杨亲缘关系最近。Michael等(1999)对西班牙的一个胡杨(P. euphratica)群体的257个样品进行AFLP分析，在个体间未检测到任何遗传变异，证明该群体为无性系起源。Maurizio等(2001)应用RAPD标记对53个银白杨(P. alba)家系进行分析并聚类，结果明显分为3类，分别对应于3个不同的地理分布区。

本研究以杨属白杨派、黑杨派、青杨派、胡杨派、大叶杨派中的部分种及杂种的44个无性系为试验材料，采用AFLP标记研究它们在DNA水平上的遗传变异，研究杨属无性系间、种间、派间及亲本与子代间亲缘关系；根据分子标记结果探讨杂交亲本间的亲和性和杂交子代早期选择的可行性，讨论分子标记与常规杂交育种的结合点。

1 材料与方法 1.1 材料

试验材料由中国林业科学研究院张绮纹研究员提供，来源于黑杨派、青杨派、白杨派、胡杨派、大叶杨派以及种间和派间杂种。其中, 黑杨派28份, 青杨派和白杨派各5份, 胡杨派和大叶杨派各1份, 派间杂种4份(表 1)。

1.2 方法 1.2.1 DNA提取

取各试验材料的嫩叶，按Murry等(1980)的方法提取各试验材料的基因组DNA，所有样品的浓度稀释至200 ng·L^-1，-20 ℃保存。

1.2.2 AFLP分析

AFLP反应程序基本按Vos等(1995)发表的方法稍加改进，采用Invitrogen公司试剂盒进行AFLP分析，并对反应程序进行了优化。预扩增采用MseⅠ+C/EcoRⅠ+0引物组合，选择性扩增采用+3/+2引物组合。采用内切酶EcoRⅠ和MseⅠ对DNA样品进行双酶切，模板DNA约500 ng。酶切后DNA片段与接头连接，稀释10倍后用作预扩增反应的模板。预扩增产物稀释30倍，用作选择性扩增反应的模板。本研究采用银染技术检测选择性扩增反应的结果。

1.2.3 聚类分析和指纹图谱的构建

统计AFLP扩增条带，清晰易于辨认的条带记录为“1”，空缺时记录为“0”。用STATISTICA软件进行分析，遗传相似系数通过公式G_s(i, j)=2N(i, j)/[N(i)+N(j)]来计算，其中N(i, j)代表所有材料共有的条带数，N(i)，N (j)分别代表每个材料的总条带数，用UPGMA(unweighed pair group method using arithmetic)法进行聚类分析。选取典型的条带构建指纹图谱，多态性条带分别用“+”和“－”代表“有”和“无”，将其转换为计算机语言分别为“1”和“0”。

2 结果与分析 2.1 AFLP分析 2.1.1 DNA的提取

大量提取DNA，然后经过纯化、定量至200 ng·μL^-1，琼脂糖胶电泳检测。如图 1所示，DNA电泳无弥散现象，可以作为下一步酶切反应的模板。

2.1.2 酶切及连接

纯化定量的基因组DNA首先用EcoRⅠ和MseⅠ完全酶切，再与EcoRⅠ和MseⅠ的特定接头连接，取1 μL酶切连接产物于1.0%琼脂糖胶上电泳，结果如图 2所示。

2.1.3 预扩增

采用EcoRⅠ+0/MseⅠ+C的引物组合在PTC-100 PCR仪上进行预扩增，扩增后取6~8 μL于1.0%琼脂糖胶上电泳检查，图 3的结果显示这些材料经酶切、连接头、预扩增后能够扩增出大量的产物。根据浓度大小将其稀释30倍后用于选择性扩增的模板。

2.1.4 选择性扩增

预扩增反应产物经过30倍稀释后，进行选择性扩增，将扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，银染检测结果(图 4)表明，条带清晰，适合用于数据统计和多态性分析。

用64对引物对44份材料进行扩增，每对引物扩增的条带范围是20~80条。例如，图 4表明引物M-CTC/E-AG的扩增结果，共获得了61条带，其中40条特异带，多态率65.6%。选取10对引物组合，对扩增条带进行统计分析(表 2)，共计588条，平均条带数为48~77条，平均数为58.8, 多态性为100%。其中，引物M-CTT/E-AC获得77条带，数量最多，而引物M-CAG/E-TA获得了48条带，数量最少。

2.2 聚类分析

在用于AFLP分析的引物组合中，根据选择性扩增产物经聚丙烯酰胺电泳所得的大量清晰条带，选取了588条多态性条带，进行遗传相似系数计算后，再经过聚类分析，构建了44份杨树材料的亲缘关系树状图(图 5)。在这44份材料中，相似系数在0.765~0.971范围内，根据相似性关系，在相似系数0.833的水平上，将这些材料可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个组。

Ⅰ组只包括了大叶杨派的大叶杨(“44号”)；Ⅱ组只有胡杨派的胡杨(“43号”)，二者之间的相似系数为0.762；Ⅲ组为银白杨(“38号”)、山杨(“39号”)、新疆杨(“40号”)、毛白杨(“41号”)、河北杨(“42号”)等同属白杨派的5份材料；其余的37份材料则为Ⅳ组，包括了黑杨派、青杨派以及派内种间和派间杂种。

在相似系数为“0.85”的水平上，Ⅳ组的材料又可以分为A、B、C、D 4个小组，B小组包括了欧洲黑杨的4份材料；D小组为美洲黑杨的4份材料；C小组由欧美杨10个无性系组成；A小组由19份材料组成，其中有青杨派5个种、欧美杨10个无性系、黑杨派与青杨派派间杂种3个、黑杨派与白杨派派间杂种1个。

2.3 指纹图谱

根据AFLP分析结果的12条多态性条带，构建了分别属于杨属五大派18个种的44份材料的指纹图谱(表 3)，这12条特异性条带都来源于M-CAG/E-TA和M-CAG/E-TC 2个引物组合的选择性扩增反应结果。在该指纹图谱中，每个材料都有自身独特的带型与其他材料互相区分，所构建的指纹图谱显示了丰富的多态性。

3 结论 3.1 将AFLP分析用于杨属五大派遗传分化研究

首次建立了杨树五大派AFLP标记分析系统，完成了杨属植物DNA的提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验过程，利用EcoR I和Mse I进行双酶切和引物对组合，得到了杨属不同派、种、无性系的清晰AFLP谱带。利用该反应系统，首次对包含黑杨派、青杨派、白杨派、胡杨派和大叶杨派等五大派的全部44份杨树材料进行了AFLP分析，44份杨树材料AFLP分析结果与其形态学数据、地理分布及来源基本一致，说明了AFLP标记用于杨树种质鉴定的可行性。

3.2 黑杨派、青杨派、白杨派间的遗传分化

利用AFLP分析谱带的588条多态性条带，进行遗传相似系数计算和聚类分析，结果表明，44份杨树材料可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个组，白杨派、胡杨派、大叶杨派聚在不同的组内，说明它们的亲缘关系较远，这符合传统的表型形态的分类结果，而青杨派、黑杨派和黑杨派内的杂交种以及派间杂种聚在了一组，说明青杨派和黑杨派的亲缘关系较近，这与李宽钰等(1996)的RAPD分析结果一致。

3.3 派内种间和种内无性系间的遗传分化

聚类分析结果表明，黑杨派的美洲黑杨4个无性系与欧洲黑杨4个无性系分别聚在了D小组和B小组，与常规分类结果相一致，也与李宽钰等(1996)的RAPD分析结果相符合。

青杨派有大青杨、青杨、甜杨、小叶杨和滇杨5个种，其相似系数在0.856~0.960之间，而在相似系数为0.856的水平上，滇杨与其他4个种之间分开，而其他4个种在相似系数为0.934时才逐渐分开。白杨派的银白杨、山杨、新疆杨、毛白杨、河北杨5个种，其相似系数为0.848~0.971，新疆杨最先在相似系数0.848水平上与其他4个种分开。

欧美杨20个无性系聚在了A小组和C小组内，其中C小组由10个欧美杨无性系组成，例如，在表型形态上非常相似的欧美杨无性系107杨和108杨聚在了C小组，而I-214杨和沙兰杨聚在了A小组，说明107杨和108杨与I-214杨和沙兰杨的亲缘关系较远。