林业科学  2007, Vol. 43 Issue (11): 170-174   PDF    
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李中新, 孙绪艮, 刘学辉.
Li Zhongxin, Sun Xugen, Liu Xuehui.
2种叶螨对银杏叶的选择性及其挥发物测定
Determination on the Selectivity of Two Kinds of Spider Mites to Ginkgo biloba Leaves and Foliar Volatiles
林业科学, 2007, 43(11): 170-174.
Scientia Silvae Sinicae, 2007, 43(11): 170-174.

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收稿日期:2007-04-20

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李中新
孙绪艮
刘学辉

2种叶螨对银杏叶的选择性及其挥发物测定
李中新, 孙绪艮, 刘学辉     
山东农业大学植物保护学院 泰安 271018
关键词:固相微萃取    气相色谱-质谱联用仪    二斑叶螨    山楂叶螨    生物测定    
Determination on the Selectivity of Two Kinds of Spider Mites to Ginkgo biloba Leaves and Foliar Volatiles
Li Zhongxin, Sun Xugen, Liu Xuehui     
Plant Protection College of Shandong Agricultural University Tai'an 271018
Abstract: The selectivity of Tetranychus urticae and Tetranychus viennensis to Ginkgo biloba leaves was determined by means of method of petri dish, and elucidated the resistance of G.biloba against spider mites, and then the influence of volatiles from G.biloba leaves on selection behavior of spider mites was explored.Volatiles from G.biloba leaves which were collected with solid phase micro extraction(SPME)and preliminarily identified by GC-MS are nonanoic acid, tetradecanoic acid, pentadecan oic acid, bexadecanoic acid, 2-pentadecanone, 6, 10, 14-trimethyl-, benzophenone, butylated hydroxytoluene, phenol, 4, 6-di(1, 1-dimethylethyl)-2-methyl, 2-buten-1-ol, 3-methyl-, 1, 8-naphthyridin-2-amine, 5, 7-dimethyl-, 9H-pyrido[3, 4-b]indol-7-ol, 1-methyl- and 4-hexen-2-yn-1-one, 1-phenyl-5-(1-piperi)and so on.The bioassay on selectivity of two kinds of spider mites to G.biloba leaves and apple leaves or clear air was carried out with Y-tube olfactometer.Results showed that the antifeedant rates of two kinds of spider mites against G.biloba leaves are all 100%.The selection rate of T.urticae and T.viennensis to G.biloba leaves in odour source group, G.biloba leaves vs.apple leaves, is 22.2% and 23.5%, respectively.It is 21.3% and 24.8% in G.biloba leaves vs.clear air, respectively.There is highly significant difference between treatments and controls, apple leaves or air.Two kinds of spider mites antifeedant against G.biloba leaves and volatiles from G.biloba leaves are an important factor that affects the selection of spider mites to hosts.
Key words: solid phase microextraction(SPME)    gas chromatography-mass(GC-MS)    Tetranychus urticae    Tetranychus viennensis    bioassay    

银杏(Ginkgo biloba)是我国的优势树种,起源于古生代二叠纪时期繁茂于侏罗纪时期,随第三纪冰川的到来而在世界上大部分地区消亡,惟独在亚洲,特别是中国得以幸免,因此又被称为活化石(Major, 1967)。银杏之所以历经数亿年而生存,原因之一是其具有抗虫、抗菌、抗病毒特性。

银杏可以利用植物本身固有的活性成分(直接防御手段)抵御各种害虫的侵害。在我国古代就有利用银杏叶水浸液防治蚜虫、红蜘蛛、稻蝗的历史。在我国和日本还有利用银杏叶夹入书本驱虫的传统,而且利用银杏木材制成的家具可免受昆虫危害(Major,1967)。银杏叶水浸液与食物按1:2配比饲喂欧洲玉米螟(Pyrauata nubilalis),8 d内,其幼虫发育抑制率为98%,死亡率90%(Major, 1967)。还有众多银杏粗提物防治桃蚜(Myzus persicae)(郑许松等,2002石启田,2000)、小菜蛾(Plutella xylostella)(郭春霞等,2004徐红星等,2002a)、菜青虫(Pieris rapae) (Matsumoto et al., 1987赵肃清等,2003王杰等,2002)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)(徐红星等,2002b; Ahn et al. .,1997Kwon et al., 1996)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)(罗彭等,2006)等报道。

二斑叶螨(Tetranychus urticae)和山楂叶螨(T. viennensis) 能取食200多种大田作物、温室植物、园艺作物、观赏植物和果树等,特别是它们容易对化学农药产生抗性,因而增加了防治难度(van Den Boom et al.,2003; 2004van de Vrie et al., 1972)。植物杀虫剂易降解、对环境友好、不易产生抗药性,成为研究热点。银杏具有抗虫特性,但对抗螨性研究较少。本文旨在通过叶螨对银杏叶选择性试验,测定其抗螨活性,并通过银杏叶挥发物测定,比较与其他植物间的差异,为抗螨性研究提供借鉴。

1 材料与方法 1.1 材料来源

二斑叶螨采自山东省东营市花卉繁育公司;山楂叶螨采自山东省泰安市群星园艺场金帅苹果树。银杏叶采自山东农业大学院内4~5年树龄嫁接树;苹果叶采自山东农业大学园艺果树研究站。

为保证使用发育一致的成螨,采用培养皿(Φ9 cm)培养:水洗后自然晾干的带柄苹果叶(叶柄用脱脂棉包裹,滴加自来水保湿),叶面向下放置于培养皿内。采集的2种叶螨的健康成螨,分别接到叶片上,盖上培养皿盖,在25~27 ℃、光周期L16:D8的实验室培养。24 h后移出成螨,由卵发育的成螨用作生物测定。

1.2 叶螨对银杏叶和苹果叶的选择性测定

在Φ15 cm培养皿内,倒扣放置Φ9 cm小培养皿,2培养皿之间的空隙充少量自来水。在小培养皿上,叶面向下平行放置经水洗自然晾干后的平展银杏叶和苹果叶(为保证叶片与培养皿紧密接触,在叶片与培养皿之间涂少量水),叶柄用脱脂棉包裹,自来水保湿。两叶片间隙1~2 cm。用折叠的滤纸剪成对称的“T”型桥(图 1),桥顶端两边分别接触银杏叶和苹果叶,叶螨放置于黑色圆点处,任其沿箭头方向自由选择银杏叶或苹果叶,2、8、12、24 h后检查每叶片的螨数,被水淹的叶螨不统计在内。山楂叶螨的选择性测定每处理10头,重复10次;二斑叶螨的选择性测定,每处理25头,重复5次。试验环境条件同叶螨培养。

图 1 “T”型桥示意图 Fig. 1 Schematic chart of "T"-shaped bridge 叶螨放在黑色圆点处,以便叶螨沿箭头方向对银杏叶或苹果叶作出选择。 Spider mites were placed on the black point so as to let them make choice for G. biloba leaf or apple leaf along the arrows.
1.3 固相微萃取(SPME)采集挥发物与气相色谱-质谱(GC-MS)测定

叶片挥发性物质的收集:取带有叶柄的银杏叶,经自来水清洗叶面杂物,自然晾干后放入500 mL的广口瓶,用封口膜封口,置于45~50 ℃的水浴锅内加热。将固相微萃取头(PA型白色平头,85 μm)穿透封口膜插入瓶内叶片上方,然后小心地推出萃取头,固定微萃取手柄。自萃取头推出后开始记时,吸附30 min,将萃取头退回针头内,立即到气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司GC-MS-QP5050)上进样分析。

空白取样:用同样大小的广口瓶采集试验环境中的空气,采取上述方法进样分析。

GC-MS分析条件:DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mmID,膜厚0.25 μm);柱温:50 ℃保持1 min,以15 ℃·min-1速率升到200 ℃,保持5 min,然后以10 ℃·min -1速率升到280 ℃,保持5 min;进样口温度:280 ℃;载气:氦气(1.0 mL·min -1);传输线温度:250 ℃;电离源:EI源(70 eV,230 ℃);扫描模式为全扫描(30~550 amu);样品解析时间:1 min。

挥发性物质的鉴定:利用NIST02a谱库检索定性,并与文献比较,扣除空气本底后采用面积归一法计算百分含量。

1.4 “Y”型嗅觉仪测定

“Y”型嗅觉仪主要由吹气泵、活性碳瓶(1000 mL)、气源瓶(1000 mL)、流量计、“Y”型管(适应臂长10 cm;两选择臂长均为20 cm,夹角75°,内径3 cm)和导气管等组成(孙绪艮等, 2002)。测试时, 气流经过活性碳过滤,两股气流通过分别装有银杏叶和苹果叶(或空气)的广口瓶,然后, 调节流速计, 使两边气流流速均为3.0 L·min-1。将叶螨的雌成螨单头接到“Y”型嗅觉仪出气口端的铁丝上, 观察其选择行为, 5 min内穿过Y型管某一臂的纱网, 被记录为对气味源选择,否则,记录为不选择。每组处理测试100头,每测试10头, 关闭吹气泵10 min, 用无水酒精擦拭Y型铁丝。为避免实验装置的不对称性造成的误差, 每测试20头叶螨交换1次进气管。所有测试均在空气洁净(无异味)、光线均匀、相对封闭的环境中进行。

1.5 数据分析

采用DPS(专业版)分析软件分析数据。单因素试验统计分析(LSD法,数据不转换)比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析 2.1 叶螨对银杏叶和苹果叶的选择性

二斑叶螨和山楂叶螨都在各测定时间上均对银杏叶没有选择性(表 1),可以推定银杏叶含有对叶螨有直接防御功能的化合物(银杏挥发性化合物或非挥发性次生代谢物)。2种叶螨对苹果叶的选择性比较强,但随着时间的延长,选择性有所下降,非选择性相应增加,8 h均为2种叶螨的选择高峰,选择率分别为62.4%和90%。

表 1 2种叶螨对银杏叶和苹果叶的选择性比较 Tab.1 Comparison of the selectivity of T. urticae and T. viennensis to G. biloba leaves and apple leaves
2.2 银杏叶挥发性成分

经SPME采集,GC-MS测定获得12种银杏挥发性成分(表 2),分别为脂肪酸(壬酸、十四酸、十五酸、十六酸)、酮(6, 10, 14-三甲基-2-十五烷酮、二苯甲酮)、苯(丁羟甲苯)、苯酚(4, 6-二特丁基-2-甲基苯酚)、3-甲基-2-丁烯醇(2-buten-1-ol, 3-methyl-)、5, 7-二甲基-1, 8-萘啶-2氨(1, 8-naphthyridin-2-amine, 5, 7-dimethyl-)、1-甲基-9H-吡哆[3, 4-b]吲哚-7-醇(9H-pyrido[3, 4-b]indol-7-ol, 1-methyl-)和1-苯-5-(1-蒎)-4-己烯-2-炔酮(4-hexen-2-yn-1-one, 1-phenyl-5-(1-piperi))。其中相对含量较高的是5, 7-二甲基-1, 8-萘啶-2-氨、二苯甲酮、4, 6-二特丁基-2-甲基苯酚和十六酸,分别为25.37%、21.67%、15.61%和10.78%。

表 2 SPME-GC-MS测定的银杏叶挥发性成分 Tab.2 Indentified volatile components from G. biloba leaves by means of SPME-GC-MS
2.3 “Y”型嗅觉仪生物测定

在2组气味源(银杏叶-苹果叶、银杏叶-空气)中,二斑叶螨和山楂叶螨对银杏叶的选择性测定结果见图 2。在银杏叶-苹果叶气味源中,二斑叶螨和山楂叶螨对银杏叶的选择率分别为22.2%和23.5%,而对苹果叶的选择率分别为37.6%和45.4%;在银杏叶-空气气味源中,2种叶螨对银杏叶的选择率分别为21.3%和24.8%,而对空气的选择率则达47.2%和40.8%。由此可见,叶螨对银杏叶的选择率显著低于对照,但不同叶螨对同一气味源的选择性差异不显著,可以初步断定无种间选择性差异。

图 2 “Y”型嗅觉仪测定二斑叶螨和山楂叶螨对银杏叶的选择性 Fig. 2 Selectivity of T. urticae and T. viennensis to G.biloba leaves with the determination of Y-tube olfactometer 数据后有相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异极显著(P < 0.01)。 The same letters behind the numbers indicate the insignificant difference(P >0.05), different letters indicate the highly significant difference(P < 0.01)
3 讨论 3.1 叶螨对银杏叶的选择性

对于叶螨与银杏叶之间的选择性关系,目前的报道较少。就选择行为而言,如果植物系植食性昆虫的非选择食物源,昆虫则围绕植物运动直至选择到合适的植物而稳定。在叶螨对银杏叶选择性生物测定中,也看到同样的现象,叶螨围绕银杏叶迅速移动,虽然有时存在短暂停留而试探取食现象,但片刻转移,螨体有明显颤抖和行动蹒跚,直到越过T型桥到达苹果叶片才稳定取食。van den Boom等(2003)在选择性试验中,得到二斑叶螨对银杏的选择率仅为11%±3%,并推测造成这种现象的可能原因是叶片中的某些次生代谢物,这些次生代谢物具有毒素、抑制剂和减缓消化的功能(Rosenthal et al., 1991Dabrowski,1973)。本试验中2种叶螨对银杏的选择率均为0,这与van den Boom等(2003)的研究结论略有出入,因为笔者在试验中以叶螨的稳定取食为统计标准(分别在2、8、12、24 h之后统计),而van den Boom等(2003)是在15 min、1 h、2 h、3 h后进行统计(叶螨未稳定取食,只是行为反应)。笔者在数据统计前,也观察到叶螨在银杏叶片上的迅速移动,但很不稳定,为避免放置的多头叶螨造成统计误差,所以选择稳定后统计。另外,学习与经历影响昆虫的取食被许多文献证实,并且这种学习行为在短时间就可以形成(Lewis et al .,1988Powell et al.,1998)。鉴于叶螨均在苹果叶上进行培养,所以难免对试验结果有影响。

在“Y”型嗅觉仪测定中,二斑叶螨和山楂叶螨对银杏叶的选择率分别为22.2%、21.3%和23.5%、24.8%,虽然它们与对照气味源(苹果和空气)差异显著,但与培养皿实验中的结果不一致(2种叶螨的选择率均为0)。其原因可能有2种:1)正如前述,统计时间不一致造成误差;2)银杏叶挥发性成分在选择行为中非关键因素,而非挥发性次生代谢物影响取食。目前,叶螨对银杏叶挥发性单体成分的选择性还没有资料证实,还不能得出明确的结论,这也是以后需要解决的问题。但是,根据试验结果可以认为银杏叶对二斑叶螨和山楂叶螨具有较强的忌避作用。

3.2 银杏叶挥发性成分

不同植物散发出不同的挥发物,即使相同的化合物其相对含量也有差别。银杏叶中的挥发性成分很少,van den Boom(2003)通过顶空气味收集测定出10种银杏叶挥发性成分,主要成分为(E, E)-α-法尼烯(57%),其他成分文献中没有明确。当用HCl或者茉莉酮酸处理叶片时,分别获得27种和757种挥发性成分,主要为:(E, E)-α-法尼烯、丁香酚、里哪醇、α-蒎烯、β-丁香烯、(E, Z)-α-法尼烯、γ-蛇麻烯,它们在相对量方面也有差别(van den Boom et al., 2004)。彭洪等(1995)利用GC-MS测定了银杏挥发油的化学成分,鉴定出17种化合物,其中,棕榈酸(15.74%)和2, 6-二特丁基-4-甲基苯酚(9.715%)含量较高。张永洪等(1998)利用GC-MS测定常压水蒸馏制得的银杏叶精油,鉴定出67种化学成分,主要为十六酸(23.48%)、雪松脑醇(15.19%)、6, 10, 14-三甲基-2-十五烷酮(10. 89%)、邻苯二甲酸丁醇异丁醇二酯(9.99%)、十四酸(3.91%)、α-雪松烯(2.69%)、橙花叔醇(1.59%)和β-桉叶醇(1.29%)等。由此可见,本试验鉴定结果与顶空测定的挥发物数量接近,但没有鉴定出(E, E)-α-法尼烯,因为不同型号的萃取头对挥发物的吸附有局限性,另外,挥发物采集方法对鉴定结果有影响。

银杏叶提取物中有众多活性成分,主要是银杏黄铜甙、银杏黄素、双黄酮、银杏萜内酯(A、B、C、M和J)、白果内酯和碳6位连有饱和或者不饱和长链烷基(C:13~19;不饱和键1~3)的银杏酚酸(高锦明等,1995)。这些成分在银杏叶挥发性成分中都没有测出。对于上述化合物,利用气相色谱测定需要对样品进行硅烷化处理,才能得到理想的测定效果(仰榴青等,2003唐红芳等,2003Chauret et al., 1991Deng et al., 2003)。

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