木兰科(Magnoliaceae)的含笑属(Michelia)树种是一类芳香植物, 具有巨大的应用潜力。近年来, 对含笑叶片成分及其活性的研究取得了重要进展(明军等, 2004)。在其提取物的抗氧化活性研究方面, 国内外都有大量报道(Deepa et al., 2006; Singh et al., 2006; Kosar et al., 2003; Bartolome et al.，2004)。Puertas等(2005)从2种木兰科植物中提取出抗氧化物质，测定其有很强的抗氧化活性。何开跃等(何开跃等, 2006; He et al., 2006)采用有机溶剂萃取法提取了深山含笑(Michelia maudiae)等树种叶片的提取物，进行了成分分析，发现其含有酚类物质和萜类化合物等, 并测定了抗氧自由基活性。目前, 国内外使用比较多的是合成抗氧化剂，但如果长期或大量使用会对人体产生毒副作用。天然抗氧化剂具有安全、无毒等诸多优势, 已逐渐受到人们的青睐和广泛关注。在食品行业, 油脂及含有油脂的加工食品常因储藏或包装不当, 极易引发油脂自氧化连锁反应, 产生过氧化脂质。人们若长期食用, 将对身体产生毒害。因此, 对抗氧化剂的筛选研制, 尤为迫切。已有的研究表明, 含笑叶片提取物具有抗氧化活性, 但对油脂的抗氧化功能尚未见报道。

本试验在已有研究结果的基础上，从4种含笑叶片中获得了乙醇提取物。在初步鉴定其成分后, 测定了其在大豆油中的抗过氧化活性, 并且建立了各样品过氧化值(POV)与时间的一级反应动力学回归方程，预测其货架寿命。由于油脂氧化所产生的氢过氧化物很不稳定, 存在时间短, 因此, 本研究用硫代巴比妥酸(TBA)测定结果来反映过氧化物的分解程度。本研究结果为开发这4种含笑属树种作为天然的抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

4年生的乐昌含笑(Michelia chapensis)、阔瓣含笑(M.platypetala)、金叶含笑(M.foveolata)和深山含笑(M.maudiae)中部营养叶片，于2006年4月采自江苏省林业科学院。

1.2 试剂和仪器

植酸(PA)：嘉善巨枫化工厂；没食子酸丙酯(PG)：国药集团化学试剂有限公司；大豆油：深圳南顺油脂有限公司；淀粉、碘化钾、冰醋酸、三氯甲烷等均为国产分析纯; 恒温培养箱; 碱式滴定管；紫外分光光度计。

1.3 试验方法

1) 提取物的分离  取各含笑叶片30 g, 采用有机溶剂提取法(卢艳花, 2005)进行分离, 并计算提取率:提取率(%)=提取物质量/材料质量×100%。

2) 提取物样品抗氧化成分的理化检识  参照翁德宝等(2005)的方法。(1)醋酸镁[Mg(CH₃COO)₂]反应：提取物点于滤纸上，以醋酸镁甲醇为显色剂，在紫外灯下观察，黄色表示有黄酮和黄酮醇成分，橙红色表示含有查耳酮。(2)与浓硫酸(H₂SO₄)反应：取0.5 mL提取物，加入2~3滴浓H₂SO₄观察，橙红色表明含有查耳酮成分。(3)与碱性试剂(1% NaOH)反应：取1.0 mL提取物，加入0.5 mL的1% NaOH观察, 呈黄色表明含有黄酮和黄酮醇成分，由黄至橙色的表示含有二氢黄酮成分。(4)盐酸-锌粉(HCl-Zn)反应：取1.0 mL提取物的乙醇溶液于试管中，加入少许锌粉振摇, 再滴加几滴浓盐酸，1~2 min内(必要时加热)显色，如溶液或泡沫处呈红色表示有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮成分。(5)与2% FeCl₃乙醇液反应：取1.0 mL提取物，加入1.0 mL的2% FeCl₃乙醇液，呈蓝绿色或绿色，表明含有酚类物质。

3) 提取物样品的UV光谱扫描  将提取物用甲醇稀释100倍，在200~400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描(翁德宝等, 2005)。

4) 提取物样品的抗氧化试验  采用Schaal烘箱法(刘赟等, 2005)。取80 g油样放入三角瓶中，敞口，加入一定量的提取物将油样放入(65±0.5)℃的恒温培养箱中强化保存，以植酸(PA)和没食子酸丙酯(PG)为对比，以乙醇为空白对照，每隔24 h搅拌1次，并交换它们在恒温箱中的位置，每隔4 d测定油样的过氧化值(POV)。

5) 过氧化值(POV)的测定  称取油样2.5 g(精确至0.01 g), 采用碘量法(Dhaouadi et al.，2006；黎源倩, 2006)进行测定。同时作空白试验。每油样重复2次，相对误差小于10%。

式中: X₁为以g·(100 g)^-1为单位的样品过氧化值; X₂为以meq·kg^-1为单位的样品过氧化值; V₁为样品消耗Na₂S₂O₃标准溶液体积(mL); V₂为空白消耗Na₂S₂O₃标准溶液的体积(mL); c为Na₂S₂O₃标准溶液的浓度(mol·L^-1); m为油样质量(g); 0.126 9为1.000 mol·L^-1 Na₂S₂O₃标准溶液1.00 mL相当于碘的质量(g); 78.8为换算因子。

6) 建立大豆油脂氧化的POV随时间变化的数学模型  通过碘量法测得POV值后, 获得POV-T(过氧化值-时间)曲线(刘成伦等, 2005)。对各条POV-T曲线进行一级反应动力学拟合, 得出各回归方程，并进行F检验。求出各大豆油的过氧化值达到预定指标12.0 meq·kg^-1(GB2716- 1988)时所需的时间(江汉湖，2002)，此即为诱导期，再还原成指数函数曲线方程(李春喜, 2005)。

7) 抗氧化性能的评价方法  采用抗氧化系数(oxidation protection factor: Pf)来表示各样品的抗氧化性能(翁新楚等, 2000)。Pf=IP_sample/IP_blank，式中Pf为抗氧化系数；IP_sample表示加入样品的大豆油的氧化诱导期(induction period)；IP_blank为未加入样品(空白)大豆油的氧化诱导期。Pf值越大，该油品抗氧化活性越强。一般来说：Pf=1，该物质既无抗氧化活性也无催化氧化活性; Pf＜1，该物质具有催化氧化活性；Pf＞1，该物质有抗氧化活性。若1＜Pf≤2，表明该物质有抗氧化活性; 2≤Pf≤3，则表明该物质具有明显的抗氧化活性; Pf＞3，该物质具有很强的抗氧化活性。

8) 丙二醛(MDA)的测定  取油样0.8 mL, 将4种含笑提取物(0.02%)、0.02% PA和0.02% PG添加到大豆油中，置于(65±0.5)℃的恒温箱中，72 h后采用硫代巴比妥酸(TBA)快速测定法(Dewir et al., 2006)进行测定。重复3次，用A₅₃₂平均值±SD表示。用Duncan法进行多重比较。吸光值越小，表明样品抗氧化活性越强。

9) 统计方法  对POV-T曲线的各数据进行非线性回归的直线化，确定曲线类型，获得直线化的方程，然后再还原为曲线回归方程(李春喜，2005)。采用STST分析软件进行F检验。

2 结果与分析 2.1 4种含笑叶片提取率

4种含笑叶片提取率分别为：乐昌含笑13.24%、深山含笑11.28%、阔瓣含笑11.05%、金叶含笑7.38%。其中乐昌含笑的提取率最高。

2.2 提取物抗氧化成分的理化检识和UV光谱

从理化检识结果(表 1)看出，4种含笑乙醇提取物都含有酚类化合物, 其中以黄酮类化合物为主, 都含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮。此外, 金叶含笑和深山含笑乙醇提取物中还含有异黄酮。

黄酮类化合物由于分子中存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系, 其甲醇溶液在紫外区域(200~400 nm)存在2个主要的紫外吸收带：峰带Ⅰ在300~400nm之间, 主要由B环桂皮酰系统的电子跃迁引起；峰带Ⅱ在220~280nm之间, 是由A环苯甲酰基系统的电子跃迁引起的。这是鉴定黄酮类化合物的依据之一(翁德宝等, 2005)。由图 1可看出，阔瓣含笑和金叶含笑峰型较相似, 吸收带Ⅰ较强, 而吸收带Ⅱ较弱, 此与查耳酮和橙酮类化合物一致, 前者带Ⅰ出现在340~390 nm之间, 后者带Ⅰ位于370~430 nm范围内。从UV图谱可看出, 这2种含笑提取物的带Ⅰ位置与查耳酮的一致。深山含笑和乐昌含笑峰型相似, 两峰几乎无强弱之分。此与黄酮和黄酮醇类一致, 前者带Ⅰ位于304~350 nm, 后者位于358~385 nm之间。从图中可看出, 这2种含笑图谱与黄酮类一致。

2.3 4种样品对大豆油抗氧化试验结果

1) 含有添加物的大豆油POV-T曲线和回归方程把4种样品(0.02%)、0.02% PA和0.02% PG添加到80 g大豆油样中，测定其POV-T曲线(图 2)。根据所测数据, 采用动力学一级反应进行拟合。一级反应方程为：

(1)

对(1)式进行积分推导得方程：

(2)

式中：c为POV值(meq·kg^-1); k为速度常数; t为时间(d); c₀为油样起始过氧化值。根据方程(2)，以lnc对t回归计算, 得到其回归方程(表 2)。

从图 2可看出, 大豆油在65 ℃下存放20 d，含有添加物的大豆油样的POV值均比空白低，诱导期也延长了。从Pf值(1 < Pf < 2)来看，4个含笑样品对大豆油都具有抗氧化功能，其中, 阔瓣含笑Pf值最大, 为1.25，与PA (1.26)和PG (1.27)较接近，其余3样品Pf较小。从表 2所建的回归模型可以看出，大豆油脂氧化过程两变量(POV和时间)间的关系符合指数函数曲线, 在热力学上为一级反应动力学。通过数据变换, 进行拟合后获得的直线方程, 只有阔瓣含笑样品在0.05水平显著, 其余都在0.01水平呈极显著。决定系数R²均较高，说明拟合出的回归方程是适合的。根据表 2中的回归方程，计算各大豆油样POV达12.0 meq•kg^-1 的时间(诱导期)和Pf值(表 3)。从表 3可看出, 阔瓣含笑的Pf值与PA和PG较接近, 为1.25。

2) 含有添加物的大豆油的货架寿命预测根据Arrhenius经验公式, 正常的化学反应, 温度每升高10 ℃, 反应速度升高1倍, 即K_{(T+10 ℃)}/K_(T)=2, 式中K为反应速度常数, 与货架寿命成反比(刘书成等, 2002)。因此有Q_(T)/Q_{(T+10 ℃)}=2，式中Q为食品货架寿命。Schaal试验的1 d相当于10 ℃储藏1个月, 即得表 4数据。大豆油的油脂预定指标为12.0 meq·kg^-1, 表示油样从起始的POV值达到12.0 meq·kg^-1时所经历的时间为氧化诱导的时间, 即为油品的贮存保质期。可由此推断油脂的货架寿命(表 5)。

从表 5中看出, 含有添加物的大豆油, 预测所得的货架寿命都得到了不同程度的延长。其中, 阔瓣含笑提取物与PA和PG较接近, 使得大豆油在25 ℃室温下货架寿命延长了1.2个月, 即36 d左右。根据表 5, 各含笑提取物的货架寿命由大到小为阔瓣含笑、深山含笑、乐昌含笑和金叶含笑。

3) 丙二醛(MDA)的测定结果由表 6可知，含有添加物的大豆油MDA测定值(A₅₃₂)都比空白低。方差分析结果表明，空白与金叶含笑、深山含笑和PA之间无显著差异，阔瓣含笑、乐昌含笑、PG与空白之间在0.05水平有显著差异。以MDA值来评价，抗氧化活性从大到小为PG、阔瓣含笑、乐昌含笑、PA、深山含笑和金叶含笑。

3 小结

天然存在的酚类化合物约有8 000多种，其中黄酮类约占一半。有研究表明，在抗脂质过氧化(LPO)过程中，黄酮类化合物可作为过氧化物阴离子以及羟自由基的清除剂，抑制脂质过氧化。其化学结构不仅有利于捕获电子，而且还赋予所形成的黄酮类自由基相当大的稳定性。油脂的氧化历程主要是自由基的连锁反应，包括引发反应、自由基传递和终止反应3个阶段。黄酮类化合物通过提供氢原子给过氧化自由基，自身形成相对稳定的酚氧自由基，从而延长脂肪氧化的诱导期，终止油脂氧化链式反应的传播，起到防止油脂继续氧化的作用。黄酮类化合物的抗氧化活性主要取决于其结构特征。本试验所鉴定的提取物中含有的5种黄酮类化合物, 其结构上的主要区别在于C环的不同。在对黄酮类化合物进行抗氧化活性的构效关系研究中发现, C环中3-羟基的存在较为重要。与缺乏3-OH取代基的黄酮类相比, 具有3-OH取代基的黄酮类是LPO潜在的抑制剂。此外, C环的2, 3-双键氢饱和化会降低抗脂质过氧化活性(唐传核, 2005)。在本试验所鉴定的5种黄酮类化合物中, 黄酮醇在C环具有3-OH, 因此, 抗氧化活性最高, 而二氢黄酮C环中, 2, 3-双键氢饱和化使其降低了抗LPO活性。据此, 可以推断, 本研究中获得的含笑提取物中, 黄酮醇在抗过氧化中起了主要作用, 其次为黄酮、异黄酮和查耳酮, 二氢黄酮C环无3-OH, 且2, 3-双键氢饱和化, 因此, 活性最低。除了抗氧化活性之外, 黄酮类化合物还可作为金属螯合剂抑制过氧化物引起的Fenton反应, 并且, 其抑制金属离子诱导的过氧化作用的效率高于过氧化自由基诱导的。食用油脂中都含有少量的金属离子如Cu²⁺、Mn²⁺等，这些金属离子能缩短链反应引发期, 对油脂氧化具有催化作用(吴春等, 2004)。所以, 本研究获得的提取物中, 黄酮类化合物与金属离子螯合物的形成也是其抗氧化机制之一。

我国是大豆的生产大国，每年约有1/3的大豆用于榨油。大豆油中，不饱和脂肪酸含量丰富，其极易与空气中的氧发生自动氧化和分解。油脂氧化后，POV值升高，同时，会产生“颜色复原”现象，其中的维生素和必需脂肪酸等营养成分遭到破坏。卫生监督结果显示，POV值超标是造成大豆油不合格的主要原因。食品的货架寿命反映的是食品的最佳使用期。目前, 常采用加速寿命试验(ASLT)来进行测定。现国内外多采用数学模型来预测(张蓉晖等，2001)。本研究结果表明这4种含笑提取物(以阔瓣含笑为最好)具有抗氧化功能, 可以延长大豆油的氧化诱导期和货架寿命, 所建立的一级反应动力学回归模型可以较好地反映各样品对大豆油的抗过氧化作用。因此, 本试验为进一步开发利用这4种含笑提供了科学依据。