在植物生长发育过程中，钙信号途径是植物细胞中重要的胞内信号转导途径，植物细胞内一切与生命活动有关的信息传递过程都是在使用Ca²⁺作为第二信使调节控制下而完成的，Ca²⁺在植物细胞分裂、分化、生长、凋亡等生命过程中均起重要作用，是植物体中无所不在的信号分子(孙大业等，2000)。植物细胞内钙信号的时空多样性，表现为钙信号的幅度、持续的时间、频率及在细胞内定位各不相同，相应地能引起细胞做出不同的反应(尚忠林等，2002；2003)，而钙信号的产生及传导是通过游离Ca²⁺浓度的变化来实现的(宋秀芬等，2001)。改变植物细胞内外游离Ca²⁺含量的水平，能影响细胞的生长和发育过程，因此细胞内游离Ca²⁺浓度的改变是钙信使系统作用机制的中心(孙天恩等，1996)。

植物有性生殖过程的调控同样存在Ca²⁺的参与(田惠桥等，2000)，对雄性生殖系统发育过程中Ca²⁺分布的研究主要集中在花粉的萌发和花粉管的生长方面(胡适宜等，2002)，而对小孢子发生和花粉发育过程，特别是花药壁中游离Ca²⁺分布水平的研究资料较少。郑茂钟等(2004)利用焦锑酸钾沉淀法研究了烟草(Nicotiana tabacum)花药发育过程中松弛结合钙的动态分布，认为Ca²⁺参与了花粉发育的调控过程。花粉发育经历了复杂的细胞学变化，体现在小孢子母细胞的减数分裂、小孢子的发育，以及雄配子的形成。在此过程中，花药细胞表现出活跃的代谢和合成活动，存在着复杂的细胞分化与脱分化过程，发生各种生理生化反应，必然涉及系列的信号转导系统，展现出花粉发育过程中Ca²⁺水平时空多样性的动态变化。为此，本文以杂种鹅掌楸(Liriodendron tul ipifera × L. chinense)为试验材料，采用激光共聚焦扫描显微技术，观察研究花粉发育过程中游离Ca²⁺分布水平的动态变化，为探索花粉发育过程中钙信号的转导过程提供基础理论资料。

试材为南京林业大学校园内栽植的杂种鹅掌楸，分别于2、3、4月采集花芽内不同发育时期雄蕊花药。

Fluo-3/AM的导入参照Zhang等(1998)的方法进行，并进行了适当修改。将40 μmol·L ^-1 Fluo-3/AM(无水DMSO溶解)加入40 mL 2.4%蔗糖溶液至终浓度为20 μmol·L ^-1，作为试验材料的孵育液。选取不同发育时期的杂交鹅掌楸花药进行冰冻切片，每一发育时期各切取10片，切片厚60 μm，将上述孵育液滴加在其中5片切片上，另外5片切片上滴加不含20 μmol·L^-1 Fluo-3 AM的1.2%蔗糖溶液作为对照材料，4 ℃避光放置2 h，然后用1.2%的蔗糖溶液清洗2次，于室温下避光孵育4 h。上述试验步骤重复3次。花药的发育时期于孵育前在显微镜下鉴别筛选。

首先将花药切片快速地在可见光下进行聚焦至图像清晰，然后关闭可见光源，再以波长488 nm的激光照射孵育好的花药切片，并利用TCS-SP2控制软件进行单次扫描(Mode: xt; Logi cal Size: 1024×1024; Speed: 200; PMT=500; Pinhole=1)，同样参数条件下扫描未装载Fluo-3/AM的同等发育时期的花药切片(来源于同一花药组织的切片)。扫描结果由TCS-S P2数据采集系统存储图像和记录数据。

利用TCS-SP2数据采集系统，在每一花药切片存储图像的同一组织区域(如中层、绒毡层等)随机选择30个区域，TCS-SP2数据采集系统给出一个Ca²⁺荧光强度值。同一发育时期同一组织区域Ca²⁺相对荧光强度值为装载了Fluo-3/AM样本的荧光强度均值减去对照样本荧光强度的均值所得的差。最后所得数据用Excel软件进行作图分析。

在杂种鹅掌楸花粉发育过程中，细胞内游离Ca²⁺的分布水平变化明显，图 1显示在花粉发育的不同时期细胞内游离Ca²⁺相对荧光强度的变化趋势。激光扫描共聚焦显微观察结果表明，初生造孢细胞中游离Ca²⁺的荧光很弱(图版Ⅰ-1)，次生造孢时期细胞中Ca²⁺的荧光强度增强，说明造孢组织细胞内游离Ca²⁺的量开始上升(图版Ⅰ-2)。随后，小孢子母细胞内Ca²⁺的荧光强度逐渐增强，在细胞内游离Ca²⁺的量达到一定程度后，减数分裂发生，形成小孢子二分体与四分体。二分体时期游离Ca²⁺荧光强度较小孢子四分体略强(图版Ⅰ-3，4)，但均低于小孢子母细胞的游离Ca²⁺荧光强度(图 1)。此外，小孢子母细胞以及发育早期的小孢子四分体胼胝质壁中Ca²⁺荧光很弱，几乎没有游离的Ca²⁺(图版Ⅰ-3，5)。小孢子四分体发育后期，胼胝质壁中游离Ca²⁺的荧光强度逐渐增强，而小孢子四分体细胞质游离Ca²⁺的荧光强度相应减弱(图版Ⅰ-6)。在小孢子时期，细胞内游离Ca²⁺荧光强度较强，但分布不均匀，在细胞质中的Ca²⁺荧光强度较弱，而在细胞壁处Ca²⁺荧光强度较强(图版Ⅱ-1)。成熟花粉时期，花粉细胞内游离Ca²⁺荧光强度明显增强(图 1，图版Ⅱ- 5)。

图版Ⅰ   Plate Ⅰ

图版Ⅱ   Plate Ⅱ

图 1 杂种鹅掌楸花粉不同发育时期游离Ca2+的相对荧光强度 Fig. 1 The free Ca2+ relative fluorescence intensity in different pollen development stages of L. tulipifera × L. chinense 1.初生造孢组织Primary sporogenous tissue; 2.次生造孢组织Secondary sporogenous tissue; 3.小孢子母细胞The microspore mother cell; 4.小孢子二分体Microspore dya d; 5.小孢子四分体早期The earlier stage of microspore tetrad; 6.小孢子四分体后期The later stage of microspore tetrad; 7.小孢子The microspore; 8.成熟花粉Matu re pollen.下同。The same below.

随着花粉的发育，杂种鹅掌楸花药壁组织的形态结构发生了一定的改变，各组织细胞中的游离Ca²⁺荧光强度也呈现出波浪型变化(图 2)。初生造孢细胞时期，药壁组织细胞内的游离Ca²⁺荧光较弱(图版Ⅰ-1)，各层细胞游离Ca²⁺荧光强度的大小差异不大(图 2)。至次生造孢细胞时期，药壁组织游离Ca²⁺荧光强度逐渐增强(图版Ⅰ-2)。小孢子母细胞发育早期，中层细胞内游离Ca²⁺荧光逐渐增强，至小孢子母细胞分裂之前，中层细胞内游离Ca²⁺荧光最强(图版Ⅰ-3)，此时药室内壁细胞和绒毡层细胞的游离Ca²⁺荧光强度也有所增加，但不如中层细胞内游离Ca²⁺荧光强度增加的明显(图 2)。随着小孢子母细胞减数分裂的进行，中层细胞内游离Ca²⁺的荧光减弱，而绒毡层细胞游离Ca²⁺荧光渐次增强(图版Ⅰ-4，5；图 2)。小孢子四分体形成后，药壁组织以绒毡层细胞的游离Ca²⁺荧光强度最强，并持续至单核花粉发育时期(图版Ⅰ-6，图版Ⅱ-1)。中层细胞在小孢子四分体形成以后，游离Ca²⁺荧光强度减弱，最后几乎观测不到(图 2)。药室内壁细胞中的Ca²⁺荧光在小孢子发育过程中亦发生了规律性的变化。在小孢子母细胞发生分裂之前，药室内壁细胞游离Ca²⁺荧光强度较弱，但在小孢子母细胞开始分裂时游离Ca²⁺荧光强度增高，而在小孢子母细胞减数分裂过程中，游离Ca²⁺荧光强度有所降低，但后期变化幅度不明显(图 2)。在小孢子发育时期，药室内壁细胞发生径向延长(图版Ⅱ-2，3，4)，细胞壁增厚，并逐渐发育形成纤维层，这时细胞内游离Ca²⁺的荧光强度增强(图版Ⅱ-4，5，6)。在二细胞花粉时期，绒毡层细胞几乎完全解体消失，纤维层荧光强度最强(图 2)，而其余的药壁组织细胞内游离Ca²⁺荧光强度较弱(图版Ⅱ-5，6)。

图 2 杂种鹅掌楸花粉发育过程中药壁组织细胞游离Ca2+相对荧光强度的变化 Fig. 2 The changes of free Ca2+ relative fluorescence intensity in anther wall tissue during the pollen development of L. tulipifera × L. chinense

Ca²⁺是植物细胞中普遍存在的信号分子，参与植物许多信号传导途径。Ca²⁺参与的信号转导过程是通过胞质Ca²⁺浓度的改变来实现的(NG et al., 2003; Sanders et al., 2002)，譬如植物表皮气孔开关与保卫细胞细胞质中游离Ca²⁺浓度增加相关。郑茂钟等(2004)利用焦锑酸钾沉淀技术研究烟草花粉发育过程中松弛结合钙的分布时，发现在减数分裂时期小孢子母细胞内出现了许多细小的钙颗粒，减数分裂后小孢子细胞质仍然具有较多的钙颗粒，同时花粉壁上也有钙颗粒沉淀在花粉外壁的基部。在杂种鹅掌楸花粉发育的不同时期，细胞质游离Ca²⁺浓度也发生了规律性的变化：初生造孢组织内Ca²⁺荧光较弱，后期逐渐增强，而在小孢子母细胞时期达到最强，说明游离的Ca ²⁺浓度随着小孢子母细胞的分化而逐渐增加。在小孢子二分体和四分体形成时期，细胞质中游离的Ca²⁺荧光强度有所下降，笔者推测子细胞的形成使得胞质中整体的Ca²⁺含量水平下降。在小孢子时期，细胞内游离Ca²⁺荧光强度有所增加。从总体水平上来看，小孢子细胞Ca²⁺荧光强度高于二分体与四分体小孢子，而与小孢子母细胞的Ca²⁺荧光强度接近，笔者推测这2个时期胞质中游离Ca²⁺的较高水平与细胞分裂的启动密切相关。

随着小孢子的发育，细胞游离Ca²⁺荧光强度逐渐增加，但分布不均匀，在小孢子壁有较强的Ca²⁺荧光，其荧光强度与正在解体的绒毡层细胞相似。在小麦(Triticum aestivum)花药发育过程中，单核花粉期药室内分布大量携带Ca²⁺的乌氏体，绒毡层的表面与花粉外壁有辐射状的Ca²⁺沉淀物存在(孟祥红等，1999)。Tian等(1998)在水稻(Oryza sativa)的研究中也观察到花粉壁表面积累大量Ca²⁺的现象。在杂种鹅掌楸花粉发育后期，细胞质游离Ca²⁺荧光增强，花粉外壁游离Ca²⁺荧光稍减弱，说明来自于绒毡层细胞的游离Ca²⁺可通过花粉外壁的构建积累并转运到二胞花粉中。龚明等(1995)研究了云南松(Pinus yunnanensis)和烟草花粉萌发过程，认为在花粉水合时花粉壁上的Ca²⁺被释放出来成为游离Ca²⁺，通过花粉细胞质膜上的Ca ²⁺通道进入到花粉内部启动花粉的萌发。因此，单核花粉表面积累大量Ca²⁺可以作为花粉的有效钙源，转运至花粉内部促进细胞的分裂和分化，而且可以成为花粉的储备钙库，参与启动花粉的萌发，甚至是花粉与柱头的识别过程(徐国华等，2003)。

花药壁在花粉发育过程中实质上起到孵育囊的作用，花粉发育时期营养物质的来源均来自于花药壁层组织的转运与分泌。Tian等(1998)在研究光敏核不育水稻花药的败育时，发现在正常可育花药的发育过程中需要大量的钙才能使花粉发育成熟，而不育花药的绒毡层和中层细胞之间形成了一层特殊的细胞壁阻碍了Ca²⁺向药室中运输，从而使花粉败育。在烟草花药发育中Ca²⁺的分布特征暗示Ca²⁺参与了调控花粉发育的过程(郑茂钟等，2004)。游离Ca²⁺的分布在杂种鹅掌楸花药药壁组织中存在明显的变化过程，造孢组织时期花药壁游离Ca²⁺荧光强度较低，随着小孢子母细胞的分化，药壁组织游离Ca ²⁺荧光强度增强，并呈现不均匀分布的特征，其中中层细胞的游离Ca²⁺荧光强度最强。在小孢子母细胞减数分裂时期，中层细胞的游离Ca²⁺荧光强度逐渐减弱，而绒毡层细胞游离Ca²⁺的荧光强度逐渐增强，并保持较强的Ca²⁺荧光强度直至绒毡层细胞完全解体消失。杂种鹅掌楸花药组织的游离Ca²⁺分布特点与利用焦锑酸钾沉淀技术定位的烟草(郑茂钟等，2004)、水稻(Tian et al., 1998)和小麦(孟祥红等，20 00)花药组织松弛结合钙的结果相似。在小孢子母细胞以及小孢子分裂分化过程中，中层细胞与绒毡层在花粉发育的特定时期高Ca²⁺的含量是一个十分有趣的问题，值得进一步研究探讨。目前，大量的研究资料阐明了Ca²⁺在细胞质中的位置和状态：可以组成细胞的结构成分；作为细胞内的第二信使；调节细胞中酶活性(NG et al., 2003; Sanders et al., 2002；Tirlapur et al., 1992)。因此，笔者推测杂种鹅掌楸花药中层细胞高的游离Ca²⁺含量与小孢子母细胞减数分裂过程的启动有关，此时绒毡层细胞仅起到转运Ca²⁺进入花药室中的作用。小孢子母细胞减数分裂后，绒毡层细胞的游离Ca ²⁺荧光强度显著增强，为小孢子发育提供了丰富的钙源。同时，花药药室的高钙状态也可能与水稻一样(Tian et al., 1998)，与吸引大量营养物质进入药室有关。

Tirlapur等(1992)用荧光方法在脂麻掌(Gasteria verrucosa)中观察到花粉发育后期药室内壁积累大量Ca²⁺，并认为可能和花药开裂有关。光敏胞质不育小麦花粉成熟时，正常花药药壁细胞中积累大量Ca²⁺，而不育花药药壁中Ca²⁺积累较少，花药不开裂也可能与Ca²⁺的积累水平有一定关系(孟祥红等，2000)。杂种鹅掌楸花药内壁的形态及其游离Ca²⁺荧光强度的变化在花粉发育早期并不明显，显著的变化发生于小孢子发育时期。随着药室内壁细胞Ca²⁺荧光强度的增高，细胞分化程度增强，药室内壁细胞径向延长，并发生细胞壁的增厚。成熟花粉时期药室内壁游离的Ca²⁺荧光强度最强，其他药壁组织中游离Ca²⁺荧光强度较弱，说明大量的Ca²⁺被转运至药室内壁细胞，以促进花药纤维层的发育，而发育成熟的纤维层有助于花药的开裂及成熟花粉的散放。

现有研究资料表明，在细胞水平上Ca²⁺浓度及其存在位置随时间的变化，反映了细胞接受外界刺激的强度，构成明显的钙签名(Ca²⁺ signature)现象(Goddard et al.，2000；Plieth Plieth，2005；Fricker et al., 2006)。杂种鹅掌楸游离Ca²⁺在花药壁组织中的分布，在花粉发育过程中表现出从外向内流动的特征，与外界刺激下细胞水平钙签名现象非常相似。然而，这种钙签名现象是发生在自然生长状态下，并未受到外界任何刺激的影响，暗示花药组织中游离Ca²⁺浓度的变化与花粉发育过程的重要环节密切相关。笔者推测在自然生长状态下，杂种鹅掌楸花药组织中Ca²⁺浓度和分布的变化可能起到化学开关和“数码"信息携带者的作用，控制着花粉的发育过程，但其相关机制有待于进一步的研究。