松茸群全球共报道15个种1变种，我国记载5个种1变种(臧穆，1990)。长白山区有2种，即松茸(Tricholoma matsutake)和假松茸(T. bakamatsutake)，同属于口蘑属。松茸是与松属(Pinus)树木共生的一种外生菌根菌，不仅菌肉肥厚、营养丰富、风味绝佳，而且具有抗癌作用(傅伟杰等，2005)。假松茸，常生于栓皮栎(Quercus variabilis)、蒙古栎(Q.mongolicus)、岩栎(Q.acrodonta)等栎类树种林下，并与其根系形成外生菌根，其个体与松茸相比相对较小，气味也不如松茸纯正，显微镜检查其褶缘有囊状体，而松茸则没有(弓明钦等，1999)。松茸与假松茸的鉴定主要依赖于传统的形态学和显微鉴定。然而，这些手段对于松茸和假松茸的准确鉴定仍显不足。

RAPD是1990年由美国科学家Williams和Welshi几乎同时采用PCR技术发展起来的一种DNA分子标记技术。因其操作简洁、快速、高效且在不了解物种基因组相关分子生物学信息下就可进行等优点而广泛应用于动植物遗传育种、基因诊断、居群遗传学、生物系统学与进化研究。

SCAR(sequence characterized amplified regions)标记是从RAPD技术衍生而来的，代表一个基因组上遗传上确定的点。这些标记通过感兴趣的RAPD片段的克隆和测序产生，通过序列分析设计出一对互补到原来RAPD片段2端的引物，用这对引物与原来的模板DNA进行扩增时，单位点的称为特征序列扩增区域(SCARs)被特异性扩增。与RAPD相比，SCAR用了一对互补到专一基因组位点上的长引物和严格的PCR条件，排除了引物结合位点之间的竞争，因而得到可靠的可重复的带，它们对反应条件不敏感(邹喻苹等，2001)。本研究在于松茸和假松茸RAPD分子标记基础上，建立具有松茸特异性的SCAR标记，以便在分子水平上快速、准确地鉴定松茸和假松茸。

1 材料与方法 1.1 供试材料

分别从吉林省汪清县、吉林省龙井市、黑龙江省牡丹江市和吉林省安图县采集松茸和假松茸子实体(经吉林省松茸专家傅伟杰教授鉴定)之后，及时带回实验室于-75 ℃超低温冰箱中保存备用(表 1)。

1.2 基因组总DNA提取

采用曾东方等(2001)的CTAB法。

1.3 RAPD分析

1) 松茸及假松茸基因池的建立  采用BSA法(邹喻苹等，2001)，分别将表 1中的5个松茸子实体和假松茸子实体中提取的DNA等量(各取500 ng)混合，组成松茸和假松茸基因池。

2) PCR反应体系  总体积为20 μL，包括模板DNA 10 ng，引物0.3 μmol·L^-1，dNTP 200 μmol·L^-1，MgCl₂ 2 mmol·L^-1，Taq DNA聚合酶1 U, 1×Buffer, 剩余用双重蒸馏水补充。

3) PCR扩增程序  预变性94 ℃ 5 min，94 ℃变性60 s，36 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s供循环45次；最后72 ℃延伸7 min。

4) PCR产物检测  PCR产物在终浓度为0.5 μg·mL^-1溴化乙锭的1.4%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE(pH8.0), 在3 V·cm^-1恒压下电泳约3.5 h左右，用Dolphin凝胶成像仪照相。为了验证RAPD的重复性，以上试验设置3次重复。

1.4 特异性片断的回收、克隆和测序

通过RAPD筛选的随机引物OPA20经PCR扩增后的产物，在1%TAE琼脂糖凝胶上电泳后，在紫外灯下切下目的DNA片断OPA20-870，转入1.5 mL离心管，按照上海华舜生物有限工程公司胶回收试剂盒说明书回收目的DNA。回收的片段与pMD18－T载体的连接, 连接到T载体质粒DNA向大肠杆菌JM₁₀₉的转化克隆, 参考莎姆布鲁克等(2003)利用碱法提取重组质粒, 用HindⅢ和BamHⅠ双酶切进行鉴定。委托大连宝生物公司测序。

1.5 SCAR引物的设计和扩增

根据测序结果及引物设计原则，设计一对含20 bp的上、下游引物，引物由华美生物工程公司合成。利用设计上、下游的引物对松茸和假松茸个体进行PCR扩增，反应总体20 μL, 除上、下游引物各0.3 μmol·L^-1，其余成分同1.3.2 PCR反应体系相同。

PCR程序为预变性94 ℃ 5 min，94 ℃变性45 s，63 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s共循环30次；最后72 ℃延伸7 min。

2 结果与分析 2.1 RAPD标记

以松茸和假松茸基因池DNA为模板进行RAPD分析，从120个随机引物中选出10个具有多态性的引物(图 1)，引物顺序为OPA08(GTGACGTAGG)、OPA16(AGCCAGCGAA)、OPA20(GTTGCGATCC)、OPB02(TGATCCCTGG)、OPB18(CCACAGCAGT)、OPC05(GATGACCGCC)、OPC08(TGGACCGGTG)、OPC20(ACTTCGCCAC)、OPD10(GGTCTACACC)、OPE16(GGTGACTGTG)，基数为松茸，偶数为假松茸。用这10个引物在构成松茸和假松茸基因池DNA的单个子实体进行扩增，只有引物OPA20在检测的松茸中均能各自扩增出一条870 bp左右的多态性条带(图 2中箭头所指)，标记为OPA20-870，而在假松茸的单株中则未见，因此该RAPD标记具有松茸特异性。

2.2 对T载体连接转化质粒DNA用HindⅢ和BamHⅠ双酶切检测

用50 μg·mL^-1的氨苄青霉素选择压，自CaCl₂感受态细胞冻融转化后的蓝白斑平板上挑取白色单克隆37 ℃摇菌培养过夜，煮沸法提取质粒DNA，用HindⅢ和BamⅠ双酶切检测获得的基因克隆，用1.5 mL的离心管在37 ℃水浴中酶切反应2 h电泳成像(图 3)。能切出约870和2 700 bp的片段(PMD18-T为2 700 bp)的克隆为阳性克隆，而且是插入一段870 bp碱基的阳性克隆，得到了预想质粒大小一致的质粒DNA。

2.3 目的片断序列测定分析

目的片断经克隆并进行酶切鉴定后，用于测序(大连宝生物公司)，测序结果为874 bp，其碱基序列如图 4。其中方框部分与PCR扩增时所用随机引物序列相同，在序列2端均有与引物OPA20结合位点，进一步证实了克隆片断的正确性。

2.4 SCAR标记引物的合成及基因组DNA扩增结果

根据引物设计原则及测得的目的片断DNA碱基序列, 在原有OPA20引物10个碱基的基础上，向内延长10个碱基，构成了上游引物；在原有OPA20引物互补基础上，向内延长10个碱基，合成其互补序列，构成了下游引物。上游引物(P1)：GTTGCGATCCTGTCCGTCCC, 下游引物(P2)：GTTGCGATCCCACTTCAAAA。

利用SCAR标记引物对松茸和假松茸基因组DNA进行扩增，松茸都能扩增出874 bp特征带，而假松茸未能扩增出任何条带，结果见图 5。为了进一步验证该标记的准确性和广泛适用性，笔者提取了吉林省松茸专家傅伟杰教授赠送的2个长白山松茸、1个日本松茸和吉林省龙井市场上购置的假松茸基因组DNA，并利用SCAR标记引物进行扩增，结果松茸都能扩增出874 bp特征带，而假松茸未能扩增出任何条带(图 6)。因此认为该SCAR标记对于鉴别松茸和假松茸是非常有效的分析方法。

3 结论与讨论

通过本研究建立的OPA20-870 bp的RAPD标记可以较快地在松茸与假松茸种群中鉴定松茸，虽然在本论文研究中经优化的RAPD体系未出现稳定性和重复性差的现象(至少重复3次以上)，但是由于不同实验室所用试剂和仪器型号不一致，有可能这个实验室的RAPD流程不一定适合其他实验室，这在很大程度上限制了RAPD标记的应用。通过将OPA20-870 bpRAPD标记转化为稳定性和重复性更高的SCAR标记，根据一对20 bp的上、下游引物对构建基因池的松茸和假松茸个体进行PCR扩增，只有松茸检出874 bp的特异性条带，而假松茸未检出任何条带，表明所筛选的SCAR标记特异性好，克服了通常的RAPD标记不稳定、不易重复等缺点。因此，此标记稳定、可靠、操作简单。

出口到日本的中国松茸价格往往与日本本土鲜松茸相比价格较低，究其原因除了松茸的贮藏保鲜技术没有到位之外，松茸中掺杂一些假松茸而导致其特有的香味不足也是一个主要原因。假松茸与松茸仅凭外观和香味很难鉴别，经本研究筛选的RAPD标记和SCAR标记可以准确、快速地鉴定松茸和假松茸，从而对提高松茸的品质和价格具有比较深远的意义。