紫锦木(Euphorbia cotinifolia)为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属常绿灌木或小乔木(中国植物志编委会，1998)，又名红叶乌桕、非洲红，具有很高的观赏价值(图版Ⅰ－1)，适合各种庭园绿化利用，紫锦木叶片提取的红色素可用于饮料、食品、化妆品等产品中(黄卓烈等，2002)。目前，对紫锦木组织培养的报道还很少。紫锦木虽可用扦插或嫁接繁殖，但繁殖系数低，用组织培养方法可在短期内得到大量试管苗(韩珊等，2006)。现在，对体胚的研究较多(Ikram-ul-Haq，2005；Linet al.，2000；Ramarosandratana et al.，2001；杜丽等，2006)。而本试验的目的在于研究紫锦木叶片离体培养诱导胚状体发生、植株再生的适宜条件, 通过对紫锦木组织培养的初步研究，以期建立基于胚状体再生植株的技术体系, 为利用组织培养进行繁殖提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

试材为四川农业大学植物苑内盆栽健壮紫锦木植株的幼嫩叶片。

1.2 方法

用1%的洗衣粉水浸泡10 min后用毛笔刷清洗外植体表面, 再用流水冲洗2 h。在无菌条件下, 用70%酒精消毒30 s, 再用0.1%升汞处理8 min, 无菌水冲洗5~6次后, 用无菌滤纸吸去表面水分, 切割成1.0 cm²大小的方块接种于诱导愈伤组织的培养基上, 黑暗培养1周后转至光培养，1个月后，转至胚性愈伤组织诱导培养基上。培养基均附加蔗糖30 g·L^-1、琼脂7 g·L^-1, pH5.8。所有材料均在光照培养室内培养, 光照时间12 h·d^-1, 光照强度2 000 lx, 温度(25±1) ℃。

愈伤组织和胚性愈伤组织的观察参见范国强等(2004)。愈伤组织诱导率=(诱导出愈伤组织外植体的数量/放置外植体的数量)×100%；胚性愈伤组织诱导率=(诱导出胚性愈伤组织外植体的数量/放置外植体的数量)×100%。将诱导的愈伤组织分别放在诱导体细胞胚发生的培养基上，30 d后观察。培养产物定期进行解剖学观察, 记录胚状体的形态发生过程，对不同发育阶段的胚状体用解剖镜显微照相。组织切片取胚状体发生高峰期的材料，用FAA固定液固定，爱氏苏木精整体染色，常规石蜡切片(10 μm)，在Motic数码显微镜下观察体细胞胚发生情况并照相，研究胚状体发生的形态和组织。

2 结果与分析 2.1 不同激素配比对愈伤组织发生的影响

将剪切好的带柄叶片接入愈伤组织诱导培养基中，经7 d暗培养, 再经1周光照后, 可明显看到叶片表面皱缩，继续观察发现，皱缩部分分裂成更小的红色颗粒状愈伤组织(图版Ⅰ－2，3)。试验采用三因素三水平完全试验设计L₉(3⁴)，每处理重复3次。

从表 1各处理之间多重比较的结果看，5、4、6号处理与其他处理间差异极显著，但5号与3号差异极显著，而4号与3号差异却不显著；5号启动率最高，达57.2%，4号次之，为49.6%；1号处理虽然与2、8、7号处理差异不显著，但其平均值最低，只有30.7%，故1号处理最差。

方差分析结果表明：6-BA、NAA和2，4-D对愈伤组织诱导率影响达极显著。比较各因素的F值大小可知，6-BA为影响愈伤组织发生的主导因子。采用LSD法进一步对6-BA、NAA和2，4-D的各浓度水平进行多重比较。6-BA为1.0 mg·L^-1时结果极显著高于另外2个浓度，即6-BA浓度为1.0 mg·L^-1对紫锦木叶片愈伤组织诱导效果最好。NAA 3浓度水平间差异极显著，浓度0.5 mg·L^-1与1.0 mg·L^-1间差异不显著，因此根据平均值大小，NAA浓度为0.5 mg·L^-1效果最佳。2, 4-D 3浓度水平间差异极显著；浓度为0.05 mg·L^-1、0.01 mg·L^-1的结果在α＝0.05差异显著，根据平均值的大小选择2, 4-D浓度为0.01 mg·L^-1，紫锦木愈伤组织诱导效果最好培养基为: MS+6-BA 1.0 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1+2, 4-D 0.01 mg·L^-1。

2.2 不同植物激素配比对胚性愈伤组织诱导的影响

将获得的愈伤组织转移至诱导胚性愈伤组织的培养基上连续继代3次后，可观察到有紫红色、生长紧密、表面有发亮的球状突起的愈伤组织形成。试验采用三因素三水平完全试验设计L₉(3⁴)，每处理重复3次。

从表 2各处理之间多重比较的结果看，5号处理极显著地高于其他处理，诱导率达56.4%；6号与4号处理差异不显著，但4号的诱导率平均值高于6号，故4号为次选；9号处理诱导率极显著地低于其他处理，仅为13.9%，为最差处理。

方差分析结果表明：ZT、2, 4-D和NAA各浓度水平间胚性愈伤组织诱导率差异达极显著，故采用LSD法进一步对3个因素的各水平进行多重比较。ZT 3水平间，1.0 mg·L^-1的平均值极显著地高于2.0 mg·L^-1和0.5 mg·L^-1的，故选择1.0 mg·L^-1ZT。2, 4-D 3水平间，0.5 mg·L^-1的平均值极显著地高于1.0 mg·L^-1和0.1 mg·L^-1的，因此选择0.5 mg·L^-12, 4-D。NAA 3水平间，NAA浓度为0.05 mg·L^-1的平均值极显著地高于0.01 mg·L^-1NAA和不加NAA的，故选择0.05 mg·L^-1NAA。胚性愈伤组织诱导的最佳培养基: MS+ZT 1.0 mg·L^-1+2, 4-D 0.5 mg·L^-1+NAA 0.05 mg·L^-1。

2.3 不同激素配比对体细胞胚胎发生的影响

将所获得胚性愈伤组织转接在含ZT、2, 4-D、NAA的MS培养基上，15 d后，陆续形成紫红色、表面发亮的原胚细胞和球形胚(图版Ⅰ-4)，颗粒状的突起较容易从愈伤组织表面脱落。继续培养，进而发生再生植株和不定芽(图版Ⅰ-5)。切片后在显微镜下观察，可看到其球形期、心形期及成熟期各阶段发育情况(图版Ⅰ-7, 8, 9)。试验采用二因素三水平完全试验设计，每处理重复3次。

从表 3各处理之间多重比较的结果看，5号和6号处理差异不显著，但极显著地高于其他处理，平均诱导率为35.4%，6号稍差一些，诱导率为30.6%；1号处理与2、3、7、9号处理差异不显著；5号诱导率最低，仅为2.5%，故为最差处理。

方差分析结果表明：ZT和NAA各浓度水平间体胚再生频率差异达极显著，采用LSD法进一步对两因素的各水平进行多重比较。ZT 3水平间差异极显著，选择ZT 1.0 mg·L^-1效果最好。加NAA与不加NAA差异极显著；浓度为0.05 mg·L^-1、0.1 mg·L^-1的NAA在α＝0.05水平上差异不显著，但浓度为0.1 mg·L^-1的平均值显著高于0.05 mg·L^-1，故NAA为0.1 mg·L^-1时紫锦木体细胞胚胎发生最多。诱导体细胞胚胎发生的最佳培养基为: MS+ZT 1.0 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1。

2.4 体细胞胚的植株再生和移栽

将诱导出体胚的胚性愈伤组织转接到MS+ZT 1.0 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1的再生培养基上，有的体胚直接发育为具有根茎分化的完整植株，有的只有芽的分化，将不定芽剪下转入不含任何激素的MS培养基中，10 d后可看到剪下的不定芽上有白色根长出, 发育成完整植株(图版Ⅰ-6)。

当根数达到2~4条、根长3~4 cm时, 可以移栽驯化。先将封口薄膜揭开，在培养室内放置2~3 d, 然后用镊子取出植株, 洗掉根部附着的培养基, 栽于备用基质上, 炼苗基质包括珍珠岩、蛭石和河砂。炼苗前，使用0.1%的高锰酸钾对基质进行消毒处理。苗栽后浇透水，初期加盖遮阳网，保温保湿，管理期间，土壤切忌太湿和注意保持空气湿度。20 d后小植株成活, 成活率可达83.3%以上(图版Ⅰ-10)。

表 4结果表明，紫锦木炼苗的4个处理结果差异极显著。处理4的结果极显著地高于其他处理，即在珍珠岩:蛭石:河砂体积比为3:2:1中的移栽成活率最高，为83.3%；处理1，即珍珠岩:河砂(1:1)中的成活率最低，为43.3%，移栽基质中加入蛭石后成活率增高。分析其原因可能是：根系的生长需要较湿润的基质，蛭石的保湿性、保温性均较好，珍珠岩吸水能力强, 纯砂的透水性好，但保湿性差。珍珠岩与河砂混合保水、保温性差，珍珠岩与蛭石混合透气透水性差，故珍珠岩、蛭石、河砂的合理配比可以部分克服以上的缺点。

3 讨论

将愈伤组织转至诱导胚性愈伤组织培养基后发现，一旦有胚状体形成，将带有胚状体的愈伤组织转至合适的培养基中进一步发育是一个关键的步骤，长时间的植物激素的刺激反而不利于胚的进一步发育，导致胚状体脱分化，愈伤组织继续增殖、扩大或形成次级胚，或由于早熟萌发中的体胚跳过正常体胚发育的某些阶段，而形成畸形苗(Raemakers et al., 1995)。探索出合适的转移和分化时期是非常重要的工作环节，试验中发现，当部分愈伤组织形成体细胞胚后，有些体胚能正常发育成成熟的体胚，直至植株再生，有些愈伤组织外形上开始转变为非胚性愈伤组织，同时有些未成熟的胚状体逐渐死掉，故在胚性愈伤组织形成后，需要适时降低2，4-D含量或去除2，4-D。有大量试验验证了2，4-D在胚性愈伤组织诱导中起着重要作用，金惠等(2003)试验结果表明，2，4-D是通过改变细胞内源IAA代谢而起作用。另外在本试验中，非胚性愈伤组织经过2次转接，少量非胚性愈伤组织才逐渐发育成胚性愈伤组织而进入分化期。由此说明，愈伤组织由分裂期到分化期是一个非常复杂的过程，受多方面因素的影响。

本试验通过紫锦木叶片进行愈伤组织的诱导，再从愈伤组织成功诱导得到了胚性愈伤组织和胚状体。胚性愈伤组织经过体胚诱导、体胚成熟、体胚萌发等步骤的处理，成功地诱导获得了体细胞胚的再生植株，且移栽成活。但体细胞胚形成的数量较少，在这方面仍需进一步研究。