杂种山杨是芬兰林业科学院培育的欧洲山杨(Populus tremula)和北美山杨(P. tremuloides)优良杂交品系，适于山地造林，平原造林长势更好，而且其生长速度和轮伐期都快于一般的山地杨树。2001年由东北林业大学引进，并且采用微体繁殖技术进行了大量繁殖和无性系测定。玻璃化现象是植物组织培养中特有的一种生理失调或生理病变，玻璃苗不易生根，移栽成活率很低(胡彦等, 2004)。杂种山杨组培过程中出现大量的玻璃化苗，在一定程度上造成了资源的浪费，也影响了杂种山杨试管苗质量的提高。近年来，国内外对引起植物组培苗玻璃化有关的培养基种类、生长调节剂浓度、琼脂浓度、透气性、温度以及光照强度等问题进行了大量的研究。其中，植物内源激素作为植物自身重要的调控物质也引起了人们的关注，但是多集中在内源激素对外植体在组织培养过程中脱分化、分化以及再生作用的研究(宋莉英等, 2006; Abou et al., 1986)，而对于玻璃化试管苗本身内源激素含量以及变化的研究较少，对山杨的相关研究还未见报道。

本研究以杂种山杨的玻璃化试管苗为材料，采用酶联免疫吸附方法测定其植株内源激素的水平，探讨杂种山杨试管苗玻璃化的生理机制，为今后从植物细胞代谢水平阐述试管苗玻璃化现象的起因提供理论参考；此外，本研究通过改变培养基组分等培养条件，探讨试管苗玻璃化的影响因素以及较好的去玻璃化的方法，为该杂种品系转化后植株扩繁铺平道路。

用于内源激素测定的试验材料为东北林业大学森林生物工程实验室培育的一个转蜘蛛神经毒肽蛋白-Bt嵌合基因杂种山杨无性系(E10490)玻璃化试管苗，同一无性系非玻璃化试管苗作对照，每种类型各13株。本研究涉及的杂种山杨玻璃化试管苗主要表现为茎叶半透明，叶表面完全无蜡质，呈淡绿色，高生长与非玻璃化苗相比没有很大差别，但叶子偏小卷曲，生根质量差或不生根。

利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定植物内源激素ABA、IAA和GA含量，测定试剂盒来自中国农业大学，测定方法参考闫绍鹏(2004)，采用Tecan酶联免疫检测仪测定试样中各种激素含量，每个样品重复3次，取平均值。计算采用回归法，用激素标样各浓度(ng·mL^-1)的自然对数与各浓度显色值的logit值的回归方程代替logit曲线，即用激素标样各浓度(ng·mL^-1)为纵坐标与各浓度显示值(OD值)为横坐标，通过统计软件(Staticstica6.0)建立回归方程。求得样品中激素的浓度后，样品的激素含量可用下式计算：A = (N·V₂·V₃·B)/ (V₁·W), 式中：A表示激素的含量(ng·g^-1FW)；V₂表示提取样品后，上清液的总体积；V₁表示真空浓缩干燥前的上清液体积(当提取的上清液全部用于真空浓缩干燥时V₁与V₂的体积是相等的)；V₃表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积；W表示样品鲜样质量；N表示样品中激素的浓度(ng·mL^-1)；B表示样品的稀释倍数。

ELISA测定表明转基因杂种山杨玻璃化试管苗内源激素IAA含量明显高于非玻璃化试管苗，从非玻璃化苗的94.66~205.71 ng·mL^-1，增加到玻璃化苗的187.72~775.12 ng·mL^-1；ABA激素含量总体相比之下变化不太大，平均从非玻璃化苗的138.11 ng·mL^-1增加到玻璃化苗的236.97 ng·mL^-1；而玻璃化试管苗GA含量的变化为153.84~380.64 ng·mL^-1，明显低于非玻璃化试管苗的GA含量289.11~676.17 ng·mL^-1。

从图 1的比较可以看出，转基因山杨非玻璃化试管苗分株内GA含量非常高，而IAA和ABA含量很低，只有GA含量的1/3~1/4，而且2种激素在每个无性系分株内含量近似1:1，IAA略高于ABA；而玻璃化试管苗无性系各分株间激素含量不是IAA含量高，就是ABA含量高，在各分株内含量差异很大，相比之下，各分株内GA含量偏低；经t检验转基因山杨非玻璃化试管苗与玻璃化试管苗植株内的ABA含量(F=34.285^**)、IAA(F=32.904^**)和GA(F=7.641^**)的差异均达到极显著水平；从总体趋势看，玻璃化试管苗ABA和IAA含量明显高于非玻璃化试管苗，而且分株内变异大，GA含量明显低于非玻璃化试管苗，分株内变异相对较小(图 2A)。由此可见，激素IAA或ABA在植株内明显升高可能是造成杂种山杨试管苗玻璃化的主要原因。同时，有报道证实GA含量的增加不但能促进生长而且能有效地阻止培养物玻璃化产生(Jain et al., 1997)。

图 1 杂种山杨无性系试管苗分株间激素含量比较 Fig. 1 Comparison of hormone contents among ramets of test-tube plants of hybrid aspen

图 2 杂种山杨玻璃化与非玻璃化试管苗激素含量比较 Fig. 2 The comparison of hormone contents of vitrificated and normal tube-tested plants of hybrid aspen

目前人们更重视植物体内源生长与抑制生长激素的相互作用，认为在生长上出现的变化都是由这些激素的比例变化来调控的。从转基因山杨非玻璃化和玻璃化试管苗ABA/GA和IAA/GA比值(图 2B)可以看出，非玻璃化试管苗的2种比值均低于玻璃化苗；其中，2种类型试管苗中IAA/GA的变异幅度都很大，非玻璃化苗的均值约为玻璃化苗的1/2；而非玻璃化试管苗的ABA/GA比值不论均值还是变异幅度均远远低于玻璃化苗。这意味着在玻璃化的试管苗中IAA和ABA分别与GA相比，其相对含量上升，而且上升的趋势较为迅速，这说明杂种山杨试管苗中3种内源激素的平衡关系出现异常，这也可能是杂种山杨试管苗玻璃化的原因之一。

本研究分别从内源激素和培养条件入手对杂种山杨试管苗玻璃化问题加以探讨。GA是组织培养过程中变化活跃的内源激素，对蛋白酶、核酸酶、淀粉酶的生物合成有促进作用(Hazra et al., 1975)，其含量的增加会使玻璃化苗的比例呈下降趋势(李景琦等, 2002)。在本试验中，转基因杂种山杨玻璃化试管苗的GA含量显著下降，可能诱发蛋白质以及核酸等物质生物合成的失调，从而导致杂种山杨试管苗玻璃化现象的出现。同时，牛自勉等(1995)对苹果(Malus pumila)的研究也认为内源激素GA急剧降低后细胞组织内部生物合成受阻，从而导致玻璃化苗的发生。

内源激素IAA对植物幼茎、叶柄等组织木质部的分化有直接作用，玻璃化后通常表现为木质素严重缺乏，但在本试验中玻璃化的转基因杂种山杨试管苗中IA A含量较高，而在非玻璃化试管苗中含量却较低，与刘伟清等(2006)的研究结果玻璃化苗中IAA含量较低，略有偏差，这可能与研究材料不同有关，也可能是由于转基因的多效性而导致植株生理失调，造成细胞组织内部的相关激素生物合成受阻所致；同时，也有学者在对转入ACC基因的番茄(生吉萍等, 2000)以及转入rolB基因的水稻(Oryza sativa)(杨特武等, 2004)的研究过程中也证实转基因植株与非转基因植株的内源激素含量在某些生理时期存在显著性差异，因此认为外源基因的转入对植物的内源激素含量可能存在一定的影响。

同时，在转基因杂种山杨玻璃化试管苗中ABA/GA和IAA/GA的比值均高于非玻璃化的试管苗，这意味着在玻璃化的试管苗中IAA和ABA与GA相比，其相对含量有上升的趋势。在高红兵等(2006)测定高浓度6-BA诱导酸樱桃(Cerasus vulgaris)的玻璃化苗时，也发现玻璃化组培苗内源激素含量比值(IAA/GA)高于非玻璃化的组培苗。因此这说明转基因杂种山杨中3种内源激素的平衡关系出现异常可能与玻璃化有关。