人体正常的氧代谢过程中形成的超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等活性氧和自由基与癌症、衰老、动脉硬化等许多疾病的发病机制都有很大关系(Moskovitz et al., 2002)。尽管人体自身具有抗氧化化合物和酶等抗氧化平衡系统以克服活性氧和自由基的伤害，但这些抗氧化物质的量仍然不足。有研究表明，人的疾病发病率与富含抗氧化剂的食品的摄入量呈负相关关系(Lu et al., 2000)。食品在储藏过程中的腐败也与活性氧和自由基有关。2, 6-二叔丁基对甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)等人工合成抗氧化剂已普遍用于食品工业，但其安全性和毒性越来越受到关注。近年来人们对天然抗氧化剂的研究和开发的兴趣呈指数式增长(Dastmalchia et al., 2007)。黑色素是由酚类或吲哚类化合物氧化聚合而成的高分子色素，广泛存在于动植物界，具有广谱的生物活性，这些生物活性都与黑色素的抗氧化性质有关(Barr, 1983)，而且这些生物活性在保健和功能性食品生产方面具有重要意义(Gokce et al., 1996；Farr, 1997)。虽然黑色素的抗氧化活性已有广泛报道(Bilgihan et al., 1995; Blarzino et al., 1999; 潘英明等，2005; 蔡华珍等，2006；朱志仁等，2007; Hung et al., 2002)，但仍缺乏对黑色素抗氧化性质较为系统的研究。山杏(Armeniaca vulgaris var. ansu)是我国北方重要的经济树种和水土保持树种，杏仁在各国广泛应用于面包、糖果、饮料等的生产中，种皮在杏仁中的含量约为50 g ·kg^-1，种皮中黑色素含量约为47 g·kg^-1 (姚增玉等，2007)。本研究采用体外试验的方法，对山杏种皮黑色素抗氧化活性进行较为系统地研究，为其进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

去壳杏仁购于陕西省麟游县。热烫法手工剥皮，用自来水将种皮冲洗净阴干备用。Folin-Ciocalteu试剂、β-胡萝卜素和二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)为Sigma公司产品(美国)，其他试剂均为国产分析纯。主要试验仪器有：8855-02型超声波清洗仪(美国Cole-Parmer仪器公司)、1700型紫外-可见光分光光度计(日本岛津公司)、RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、5804型高速大容量离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 山杏种皮黑色素的提取和纯化

黑色素的提取参考姚增玉等(2007)的方法。10 g山杏种皮以150 mL NaOH水溶液(0.5 mol·L^-1)在氮气的保护下60 ℃水浴中提取2次，每次12 h。提出液经棉布粗虑、离心，HC1酸化得黑色素沉淀，然后用7 mol·L^-1 HCl溶液100 ℃水解6 h，离心，再依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤，所得黑色素颗粒用0.5 mol·L^-1 NaOH水溶液超声辅助溶解，离心，上清液用2 mol·L^-1 HCl酸化至pH值小于2.5，所得沉淀再用0.5 mol·L^-1 NaOH溶解，如此反复沉淀4次，得到的胶状黑色素放入-5 ℃的冰箱中使之冻结，然后室温下解冻，离心，得到的颗粒状山杏种皮黑色素用蒸馏洗涤至离心上清液C1^-定性检测为阴性，最后真空干燥。

分析山杏种皮黑色素溶液参照Sava等(2001)的方法配制。用少量0.2% NH₄OH将黑色素在氮气的保护下超声辅助溶解，用旋转蒸发仪减压抽去氨气，直至pH值达7.5。用去离子水配制成所需浓度的溶液。

1.3 在β-胡萝卜素—亚油酸乳化液模型中的抗氧化活性测定

参考Pratt等(1984)的方法。1 mL β-胡萝卜素的氯仿溶液(5.2 mg· mL^-1)与40 mg亚油酸以及400 mg吐温20混合于烧瓶中，在40 ℃下用旋转蒸发仪抽去氯仿，然后缓慢加入100 mL双蒸水并剧烈摇动制成乳化液。同时另取一烧瓶不加β-胡萝卜素溶液，其他同前。在各试管中加入5 mL β-胡萝卜素—亚油酸乳化液和1 mL不同浓度的试样，摇匀后立即测定470 nm处的吸光度，作为0时刻的吸光度，然后将试管置于50 ℃水浴锅中温浴，此后每隔30 min测定一次吸光度直至不含抗氧化剂的空白管中的颜色褪至无色。用于仪器调零的乳化液由5 mL不含β-胡萝卜素的乳化液和1 mL双蒸水组成。抗氧化活性(antioxidant activity，AA)计算方法如下：AA(%)=[1-(A_t-A₀)/(A′_t-A′₀)]×100。其中：A₀和A′₀分别为0时刻测试样品和对照的吸光度，A_t和A′_t分别为1 h后测试样品和对照的吸光度。

1.4 清除羟自由基(·OH)活性的测定

采用邻二氮菲-Fe²⁺氧化法，参照凌关庭(2004)的方法。1)向15 mL试管中依次加入0.75 mol·L^-1邻二氮菲溶液1 mL，PBS(0.2 mmol·L^-1，pH=7.4)2 mL和双蒸水1 mL，充分摇匀后加入0.75 mmol·L^-1硫酸亚铁溶液1 mL，混匀，加0.01% H₂O₂ 1 mL，于37 ℃下温浴60 min，于536 nm处测其吸光度，其值称A_f。2)同1)，唯其中用1 mL双蒸水代替1 mL H₂O₂，测得的吸光度称A₀。3)用试样1 mL代替1)中的1 mL双蒸水，测得的吸光度称A_x。4)同1)，唯其中用1 mL试样代替1 mL H₂O₂，测得的吸光度称A_s。清除羟自由基活性(hydroxyl radical scavenging activity，HRSA)计算方法为：HRSA(%)＝[1-(A_s-A_x)/(A₀-A_f)]×100。

1.5 清除超氧阴离子自由基()活性的测定

采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光还原法测定。具体操作参考Duan等(2007)的方法。39 mmol·L^-1 L-蛋氨酸(Met)、0.225 mmol·L^-1氯化硝基四氮唑兰(NBT)、0.6 mmol·L^-1乙二氨四乙酸二钠(EDTA-Na₂)和0.012 mmol·L^-1核黄素(VB₂)均以0.05 mol·L^-1 pH=7.8的混合磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂配制。试验时向同规格的各个微烧杯中一次性加入反应混合液(Met:NBT:EDTA-Na₂＝2:2:1)5 mL，然后向调零烧杯和对照烧杯中加入0.5 mL双蒸水，向样品本底吸收校正组和试验组烧杯中加入0.5 mL 20~500 μg·mL^-1的试样，最后各烧杯均加入1 mL VB₂，立即将空白和样品本底吸收校正组放入暗处，其余烧杯放于光照箱，在25 ℃下照光15 min，立即遮光终止反应，测定560 nm处吸光度。清除超氧阴离子活性(superoxide anion-scavenging activity，SAA)按下式计算：SAA(%)=[1-(A-A_j)/A′]×100。其中：A为试验组吸光度，A_j为样品本底吸收校正组吸光度，A′为对照组吸光度。

1.6 清除二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)活性的测定

参照Sanchez-Moreno (2002)的方法。0.2 mL各浓度的试样与5 mL 0.1 mmol·L^-1 DPPH·甲醇溶液混合，于室温下遮光放置30 min，测定其在517 nm下的吸光度值(A)；以0.2 mL双蒸水代替样品为空白对照(A′)；以0.2 mL样品与5 mL甲醇混合液为样品本底吸收校正(A_j)；甲醇调仪器零点。清除二苯代苦味酰基自由基活性(DPPH·scavenging activity，DSA)按下式计算：DSA(%)=[1-(A-A_j)/A′]×100。

1.7 还原力测定

参照Oyaizu (1986)的方法。取0.25 mL不同浓度(20~500 μg·mL^-1)的试样溶液，加入200 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH＝6.6)和1% K₃Fe(CN)₆各2.5 mL，混合均匀后于50℃反应20 min。取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸混匀，而后于650 g离心10 min。取上层溶液5.0 mL加入蒸馏水5.0 mL，0.1% FeCl₃ 1.0 mL，测定700 nm处吸光度。吸光度越大说明还原力越强。

1.8 总多酚含量的测定

总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法(Spanos et al., 1990)，并略有改进。其值用没食子酸的量表示(mg·g^-1)。方法如下：1 mL山杏种皮黑色素溶液、没食子酸标准溶液或去离子水(作为空白)分别加入20 mL试管中，然后加入5 mL 0.1 mol·L^-1 Folin-Ciocalteu试剂摇匀并在室温下静置5~8 min。再加入4 mL Na₂CO₃ (7.5% W/V)溶液。摇匀后室温下静置2 h，测定760 nm处的吸光度。

1.9 统计分析

每一个处理独立重复3次。所有试验数据表示为平均值±标准差(SD)，采用SAS V 8.1进行单因素方差分析和Tukey多重比较检验不同平均值间的差异。显著水平设P＜0.05。

2 结果与分析 2.1 在β-胡萝卜素—亚油酸乳化液模型中的抗氧化活性

β-胡萝卜素是一种多烯色素，在反应体系中，亚油酸氧化产生的过氧化物能使β-胡萝卜素褪色，随时间的延长吸光度越来越小，当反应体系中有抗氧化剂时，褪色速度减缓，且褪色程度与抗氧化活性呈负相关。由图 1可知，山杏种皮黑色素、2, 6-二叔丁基对甲酚(BHT)和抗坏血酸(VC)对β-胡萝卜素—亚油酸自氧化体系均有明显的抑制作用，抑制能力大小顺序为BHT>山杏种皮黑色素>VC。山杏种皮黑色素和BHT的抗氧化活性呈量效关系，而VC的抗氧化活性则各浓度间无显著差异。在试验条件下，较高浓度的山杏种皮黑色素(500 μg·mL^-1)几乎可以完全抑制体系中β-胡萝卜素的氧化。

2.2 清除羟自由基活性

羟自由基是目前所知活性氧中活性最强、危害最大的一种自由基，在生物体内，可与脂类糖类、多肽、蛋白质、DNA，特别是硫胺和鸟苷发生反应(Lee et al., 2004)。图 2表明3种抗氧化剂均具有清除羟基自由基的能力，且在试验的浓度范围内，各抗氧化剂清除·OH的作用都呈量效关系。各试验浓度下，山杏种皮黑色素清除羟自由基能力与BHT均无显著差异，在浓度较低时(20~100 μg·mL^-1)，山杏种皮黑色素清除羟自由基能力与VC无显著差异，当浓度增加到200 μg·mL^-1后，山杏种皮黑色素清除羟自由基能力显著高于VC(P＜0.01)。

2.3 清除超氧阴离子自由基活性

生物体内包括酶系统在内的许多生理反应可以产生超氧阴离子，如脂肪氧合酶、过氧化物酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和黄嘌呤氧化酶等(Duan et al., 2007)。特别是在氧化胁迫下，超氧阴离子浓度急剧增大。虽然它是一种活性相对较低的活性氧，但它在生物体中的羟自由基、过氧化氢、单线态氧等活性氧的形成过程中起着重要作用(Bloknina et al., 2003；Liu et al., 2000；Lee et al., 2004)。由图 3可知，3种抗氧化剂均具有一定的清除超氧阴离子活性的能力，但在100~500 μg·mL^-1的浓度范围内，山杏种皮黑色素活性最强。

2.4 清除DPPH·活性

清除自由基的机制在于抗氧化剂抑制脂质过氧化(Bloknina et al., 2003)。DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链式反应的作用(凌关庭，2004)。由图 4可知，山杏种皮黑色素具有显著地清除DPPH·能力，且在试验条件下，清除DPPH·活性与浓度线性正相关(相关系数为0.999 9)，浓度≤200 μg·mL^-1时其清除能力显著低于BHT和VC，浓度增至500 μg·mL^-1时，3种抗氧化剂的清除DPPH·活性无显著差异，均接近100%。但是作为合成抗氧化剂的BHT使用限量为200 μg·mL^-1 (Suja et al., 2005)，而天然抗氧化剂则无此限制(Duan et al., 2007)。

2.5 还原力

物质的还原力是潜在抗氧化性能的重要体现(Oyaizu, 1986)。如图 5所示，当浓度为100~ 500 μg·mL^-1时，对吸光值数统计分析得出，在同一浓度下，各样品之间均存在显著性差异(P＜0.01)，其中，山杏种皮黑色素的还原力最强，说明其具有强的供电子能力。在浓度≤200 μg·mL^-1时，3种抗氧化剂的还原力均与浓度呈线性正相关，黑色素、BHT和VC的相关系数分别为0.993 1(y=0.007 5x-0.065)、0.979 3(y=0.001 9x+0.027 6)和0.999 9(y=0.003 6x+0.000 4)。

2.6 总多酚含量

植物黑色素一般由酚类物质氧化聚合而成，黑色素可以处于不同的氧化还原状态，在氧化过程中酚羟基被氧化成醌基，总多酚含量降低，因此，总多酚含量可用于评价黑色素的氧化程度。Hung等(2002)采用β-胡萝卜素—亚油酸乳化液模型对茶叶黑色素的抗氧化性能研究表明，氧化程度越低黑色素抗氧化活性越强。因此总多酚含量可以作为衡量黑色素抗氧化活性的一个间接指标。Hung等(2002)从茶叶中提取得到2种黑色素，Ti³⁺为还原剂对这2种黑色素进行还原以提高其抗氧化活性，1 g还原后的茶叶黑色素总多酚含量分别相当于28.2和8 4.4 mg没食子酸。本研究结果表明，1 g山杏种皮黑色素中的总多酚含量相当于(267.0± 17.8)mg没食子酸，远远高于还原后的茶叶黑色素。

3 结论与讨论

长期食用含有人工合成抗氧化剂的食品，可以影响人体健康(Martinez-Tome et al., 2001)，植物来源的食品添加剂越来越受到青睐。植物来源的食品添加剂，特别是植物黑色素，不仅可以作为食品色素，还具有保健和治疗疾病的功能，如抗蛇毒(Hung et al., 2004)、抗癌(El-Obeid et al., 2006)、抑制HIV复制(Kerestes et al., 2003)、免疫促进(Sava et al., 2001)和治疗帕金森症(David et al., 1993)等，因此这类化合物受到越来越多研究人员的关注，黑色食品也以其在滋补、养生、抗衰老等方面的功效引起人们的浓厚兴趣。体外试验结果表明：山杏种皮黑色素具有较强的抗氧化能力，可以明显抑制β-胡萝卜素—亚油酸乳化液的氧化褪色，具有强的清除羟自由基能力，其效果接近BHT而高于VC，清除超氧阴离子能力超过BHT和VC。山杏种皮黑色素既可以作为氢供体，清除DPPH自由基，但清除能力低于BHT和VC，也可作电子供体，其还原能力高于BHT和VC。山杏种皮黑色素的这些抗氧化性质为其作为天然抗氧化剂应用于功能性食品和医药等领域开辟了广阔的前景。