银杏(Ginkgo biloba)是第四纪冰川之后保存下的孑遗物种。在其漫长的演化历程中, 通过天然杂交和人工选择, 银杏的种子和叶片发生了明显的形态变异(邢世岩, 2004)。1891年Shirai在日本发现银杏有不正常的种子形成(Sakisaka, 1927)。1927年Makino首次把叶籽银杏定为一个变种:Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.(郭善基, 1993), 该变种以后被Matsudam (1932)、Yatoh (1941)、吉冈金市(1967)、彭日三(1 9 95)等引用。目前中国和日本共发现叶籽银杏约40余株(李士美等, 2007)。Florin (19 31)曾报道在正常银杏叶的下表皮可以观察到双气孔。许多植物学家通过银杏化石种和现生种的气孔参数对比分析来恢复古大气的CO₂浓度(Chen et al., 2001; Sun et al., 2003)。贺晓等(1997)利用扫描电镜对正常银杏叶片的表皮发育进行观察发现:银杏叶表皮的发育成熟的方式是由叶基向叶缘逐渐推进的。彭方仁等(2003)认为银杏叶片分泌腔是以裂溶生方式形成的。然而关于叶籽银杏的叶解剖结构及气孔特性国内外未见报道。叶籽银杏作为银杏家族中的特异种质, 对研究银杏的起源和演化有重要意义。本研究以我国发现的第1株叶籽银杏为试材, 对其叶解剖结构及气孔特性进行了系统的观察和研究, 以期为叶籽银杏的系统进化、分类地位的研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试材取自在中国发现的第1株叶籽银杏, 地点为山东省沂源大贤山织女洞林场。该树树龄800年, 高25.3 m, 枝下高3 m, 胸径102.2 cm, 树冠呈长卵形, 冠幅东西长20.5 m、南北长16.3 m, 每年均有叶生拟胚珠形成(图版Ⅰ-1、2)。于2005、2006年3月10日-6月4日分期采此树正常叶和着生叶生拟胚珠的叶, 并用FAA固定后低温保存, 进行室内测定。

图版说明

1. 正在发育的叶生拟胚珠; 2. 发育成熟的叶生拟胚珠; 3. 正常叶片横切面; 4. 叶生 拟胚 珠叶片横切面; 5. 分布在突起两侧的叶脉; 6. 分布在突起正上方的叶脉; 7. 正常叶叶 柄 横切面; 8. 叶生拟胚珠叶叶柄横切面; 9. 具4、5和6个副卫细胞的气孔; 10. 具7个副 卫细 胞的气孔; 11. 上表皮发育正常的气孔; 12. 上表皮未完全发育的气孔; 13. 叶生拟胚 珠叶片下表皮排列不规则的气孔行; 14. 双气孔; 15. 共具一个副卫细胞的2个气孔。

1. The developing ovule-like organ on the leaf; 2. The mature ovule-like organ on the leaf; 3. The cross section of normal leaf blade; 4. The cross section of leaf with ovule-like organ; 5. The veins distributed at the both sides of the ridge; 6. The vein distributed just above the ridge; 7. The cross section of t he petiole of normal leaf; 8. The cross section of the petiole of the leaf with ovule-like organ; 9. The stomata with 4, 5 and 6 subsidiary cells; 10. The stomata with 7 subsidiary cells; 11. The normally developed stomata in upper epidermis ; 12. The underdeveloped stomata in upper epidermis; 13. The stomata arranged irregularly in rows in the lower epidermis of leaf with ovule-like organ; 14. Double stomata; 15. The two stomata sharing one subsidiary cell.

O: 叶生拟胚珠Ovule-like organ on the leaf; Cuticle: 角质层; Upper epidermis: 上表皮; Lower epidermis: 下表皮; Xylem: 木质部; Phloem: 韧皮部; Palisade: 栅栏组织; Spongy: 海绵组织;Vein: 叶脉; Stomata: 气孔; Druse: 晶簇; Mesophyll: 叶肉; Secretory cavity: 分泌腔; Ridge: 脊状突起; Parenchyma cell: 薄壁细 胞; Epidermis: 表皮; Lignified cell: 木质化细胞; Guard cell: 保卫细胞; Subsidiary cell: 副卫细胞。

标尺Bar: 3: 50 μm; 4: 25 μm; 5: 100 μm; 6: 50 μm; 7: 100 μm; 8: 100 μm; 9-15: 5 μm.

1.2 试验方法 1.2.1 叶片特性研究

取FAA固定后24 h以上的叶片, 正丁醇梯度脱水、透明, 常规石蜡切片法制样, 切片厚度8~12 μm, 番红-固绿对染, 加拿大树胶封片。在显微数码图像分析系统(NikonE220, 江南光电)的显微镜不同的倍数下观察、测量和照相。

1.2.2 气孔特性研究

气孔的观察方法用简单印迹法(常朝阳等, 1989)。在显微数码图像分析系统(NikonE220)的显微镜不同的倍数下观察、测量和照相。气孔密度的测定参照郑英群等(2003)的方法。测量9个气孔的保卫细胞的长和宽, 重复3次。气孔指数(SI, stomatal index) SI=S/(S+E), 式中:S为一定面积内气孔的数目, E为相同面积内表皮细胞的数目。气孔比密度(SRD, relative stomatal density) SRD=A·B·SD, 式中:A为气孔的长度, B为气孔的宽度, SD为气孔密度(stomatal density)。

2 结果与分析 2.1 叶片横切面结构

叶籽银杏叶片分为正常叶和叶生拟胚珠叶(the leaf with ovule-like organ)2种类型。

正常叶片横切面上由表皮、叶肉和叶脉组成。上表皮具明显的角质层, 细胞1层, 多呈长形, 排列紧密, 明显较下表皮细胞大。下表皮角质层较上表皮薄, 细胞1层, 多呈近椭圆形, 排列不规则。叶肉由栅栏组织和海绵组织构成(图版Ⅰ-3), 栅栏组织1~2层, 海绵组织发达, 胞间隙较大。叶肉细胞内有晶体分布, 通常形成晶簇。叶肉分泌腔与叶脉交替出现。叶脉由木质部和韧皮部组成。木质部位于近轴面, 由管胞和薄壁细胞组成; 韧皮部位于远轴面, 由筛胞和韧皮薄壁细胞组成。维管束鞘未形成完整的一圈。

叶生拟胚珠叶片分为正常部位和着生叶生拟胚珠部位。与正常叶片不同的是, 其叶肉无栅栏组织和海绵组织之分(图版Ⅰ-4)。此外, 着生叶生拟胚珠部位存在脊状突起。突起处的叶肉由大型薄壁细胞构成, 叶脉位置分叶脉在突起的两侧(图版Ⅰ-5)和叶脉在突起的正上方(图版Ⅰ-6)2种类型。其叶脉均较正常部位的叶脉粗大、密集。

2.2 叶柄横切面结构

横切面上, 正常叶叶柄呈半圆形(图版Ⅰ-7)。主要由表皮、基本组织和维管束组织组成。表皮细胞1层, 细胞小而致密, 椭圆形, 某些部位细胞外壁呈犬牙状突起, 角质层不明显。皮层细胞差异较大, 壁薄, 椭圆形居多, 胞间隙较小; 紧贴表皮的1层皮层细胞, 细胞较小, 多为厚壁细胞。中部有2枚维管束, 分生呈"八"字形, 横切面上每枚维管束呈椭圆形。木质部和韧皮部内外排列。木质部由管胞和薄壁细胞组成; 韧皮部由筛胞和韧皮薄壁细胞组成。分泌腔2~3个, 常位于皮层边缘。

与正常叶叶柄不同的是:叶生拟胚珠叶叶柄的横切面呈马蹄形, 紧贴表皮的皮层由2~3层厚壁细胞构成。此外, 在紧贴韧皮部外侧的皮层中存在3~4层木质化的细胞(图版Ⅰ-8)。

2.3 气孔特性研究

叶籽银杏叶片(正常叶和叶生拟胚珠叶)气孔器为单环式, 由2个保卫细胞和1圈副卫细胞构成(图版Ⅰ-9); 保卫细胞下陷, 从叶片横切面上可观察到保卫细胞横切面为肾形。与正常银杏相同(陈立群等, 2004), 围绕每个气孔的副卫细胞数目4~7个(图版Ⅰ-9、10), 大多数为5、6个(图版Ⅰ-9)。

2.3.1 气孔密度、指数和气孔比密度

从气孔密度的动态变化来看, 2种类型叶的气孔密度均逐渐减小, 但正常叶的气孔密度减小速率是叶生拟胚珠叶的2倍。此外, 观察期内各时期正常叶的气孔密度均小于叶生拟胚珠叶。前者的平均为80个·mm^-2, 而后者为100个·mm^-2。

观察期内, 正常叶的气孔指数总体上小于叶生拟胚珠叶。2种类型叶的气孔比密度均呈上升趋势, 但叶生拟胚珠叶的气孔比密度上升的速率较快, 在发育后期超过正常叶片。

2.3.2 气孔的分布

叶籽银杏叶片(正常叶和叶生拟胚珠叶)为两面生气孔型。但上表皮的气孔大多零星分布在叶片基部和中部, 而且不同的叶片气孔密度变化较大。上表皮的气孔多数发育正常(图版Ⅰ-11)且与下表皮无明显区别, 但也观察到未完全发育的气孔(图版Ⅰ-12)。气孔主要分布在下表皮, 但是多集中在脉间区且观察到有些叶片气孔沿叶脉排列成不规则的气孔行(图版Ⅰ-13)。

2.3.3 气孔长和气孔宽

随着发育期的延长, 气孔长度呈增大趋势, 但前期叶生拟胚珠叶片的气孔长度较正常叶片的大, 后期反之。可能与2种类型叶的叶面积和其生长速率有关。整个观察期内, 正常叶片的气孔宽均大于叶生拟胚珠叶。

2.3.4 双气孔

与银杏相同(Florin, 1931), 叶籽银杏也有双气孔现象。2个气孔的保卫细胞端接端地成直线连接在一起, 中间缺乏副卫细胞, 而共用1圈副卫细胞(图版Ⅰ-14)。另外, 还观察到2个气孔靠近而不紧贴, 2对保卫细胞之间有1个共同的副卫细胞(图版Ⅰ-15), 但这种气孔不列入双气孔类型(李正理等, 1989)。

3 结论与讨论 3.1 叶籽银杏叶片解剖特性

与银杏相同(彭方仁等, 2001; 谢洋等, 2005), 叶籽银杏正常叶有栅栏组织和海绵组织之别; 叶生拟胚珠叶则不同, 其叶肉基本为同型薄壁细胞。根据观察, 叶生拟胚珠叶着生胚珠部位突起处的叶肉细胞较叶正常部位的大且维管束粗大、密集。Sakisaka (1927;1929)和Soma (1999)认为:在日本, 4月上旬, 叶籽银杏芽开始舒展前, 有些叶片叶缘开始出现细长的白色脊状突起, 突起部分叶肉细胞比较疏松; 随着叶子的生长, 突起继续膨大如虫瘿状, 继而出现叶籽银杏雏形。可以推测, 叶生拟胚珠的发生可能和疏松的叶肉细胞这一特殊构造有关, 但其发生机制有待进一步研究。粗大且排列紧密的维管束, 显然有利于胚珠和叶生拟胚珠发育所需物质的运输(马丰山等, 1991)。脊状突起处的维管束的分布有2种类型。作者推测分布在突起正上方的维管束可以充分地给叶生拟胚珠输送营养, 使之最终发育成熟。而分布在突起两侧的维管束由于不能集中供给营养, 导致叶生拟胚珠在发育过程中脱落。该结论首次从解剖学角度解释叶生拟胚珠大量脱落机制。

与Sakisaka (1929)的研究结果相同, 叶籽银杏叶生拟胚珠叶叶柄维管束和正常叶、银杏叶叶柄维管束(Fujii, 1896)相似, 都是2束。这一结果无疑从解剖学方面为银杏胚珠的叶生性(Eames, 1952; Fujii, 1896; Sakisaka, 1929; 杨永等, 2001)提供了证据。然而, 叶籽银杏叶生拟胚珠叶叶柄紧贴表皮的皮层由2~3层厚壁细胞组成, 这一构造在银杏中未见报道。傅德志等(1993) "苞鳞-种鳞复合体" (bract-scale and seed-scale complex)理论认为银杏结实结构长柄先端的二叉分枝(珠柄)是由可育性的大孢子叶的叶柄演化而来的。而叶籽银杏叶生拟胚珠叶叶柄也许代表了银杏珠柄演化过程中的一种过渡类型。

3.2 叶籽银杏气孔特性

整个观察期内, 叶籽银杏正常叶的气孔密度和气孔指数均小于叶生拟胚珠叶; 在发育后期叶生拟胚珠叶的气孔比密度也超过正常叶。脊状突起出现以后这种趋势更加明显。这可能是由2种类型的叶面积差异造成的。因为为了满足叶生拟胚珠发育的营养需求, 叶生拟胚珠叶明显较小(马丰山等, 1991)。

关于银杏类植物气孔器的类型, 一直存在多种不同的看法, 目前尚无定论。Pant等(1964) 和贺晓等(1997)认为是单环式气孔器; Kausik (1974)则认为是双环式(通常不完全)气孔器。作者认为叶籽银杏气孔器是单环式的。因为个别副卫细胞在成熟以后, 其形状仍与表皮细胞相似(李正理等, 1989), 在外观上不易辨认。此外, 现代银杏中, 气孔在下表皮分布密集, 因此使某些表皮细胞呈现围绕气孔器分布的状态(陈立群等, 2004)。作者在观察叶籽银杏叶片上表皮气孔的过程中, 只发现有一圈较为特化的副卫细胞, 而且分布在下表皮的气孔, 其副卫细胞之外未见有规则排列、形状特化的表皮细胞。

早期, 银杏都是作为典型的气孔下生的类型被认知, 但Kanis等(1963)、Kausik (1974)和李正理等(1989)均证实在银杏叶片的上表皮分布有气孔。作者亦发现叶籽银杏叶片上表皮分布有气孔。气孔大多零星分布在叶片基部和中部, 而且不同的叶片气孔密度变化较大。此外, 上表皮的气孔多数发育正常, 但也观察到有未完全发育的气孔。叶籽银杏叶片上表皮气孔的发现对银杏的上表皮是否有气孔分布与性别有关(Kanis et al., 1963)的说法提出异议。同时, 从一些灭绝的银杏的化石来看, 双面气孔的叶片确实在早期的银杏科(Ginkgoaceae)的成员中存在过(Kanis et al., 1963; 周志炎, 2003; Wang et al., 2005)。叶籽银杏叶片上表皮也有气孔也许从一个侧面证实了叶籽银杏的"返祖性。

3.3 叶籽银杏亲缘关系的探讨

就目前研究结果来看, 银杏与其他裸子植物和蕨类的亲缘关系一直没有定论(Foster et al., 1983;王伏雄等, 1983; 傅德志等, 1993; 邢世岩等, 1996; 杨永等, 20 01; Royer et al., 2003)。从叶的解剖特点来看, 叶籽银杏叶内富于可与苏铁类的粘液沟和松柏类的树脂道相比拟的分泌腔(Takhtajan, 1963)。叶籽银杏正常叶叶肉可分化出栅栏组织和海绵组织, 这是和苏铁(Cycas revoluta)、松柏类(conifers)的杉属(Cunni nghamia)和红杉(Larix potaninii)等共有的特征(李正理等, 1984); 叶生拟胚珠叶叶肉由同型薄壁细胞组成, 这与科达类(Cordaites)和松科(Pinaceae)大多数植物(Takhtajan, 1963)相似。马丰山等(1991)指出银杏"正常大孢子叶球"是由这种着生胚珠的叶通过逐渐丧失绿色薄壁组织而简化的结果。银杏叶片叶肉有栅栏组织和海绵组织之别(彭方仁等, 2001; 谢洋等, 2005), 而叶生拟胚珠叶则完全保留着绿色薄壁组织, 说明胚珠的叶生性可能是一种更为原始的性状。此外, 叶生拟胚珠叶叶柄在紧贴韧皮部外侧的皮层中存在3~4层木质化细胞, 这种结构在银杏及其他裸子植物中未见报道。作者推测这也许是银杏类祖先的性状, 因为关于叶籽银杏的发生, 国内研究者多认为属"返祖现象"(atavism)(马丰山等, 1991; 傅德志等, 1993; 彭日三, 1995; 杨永等, 2001)。

基于叶生胚珠现象和银杏的二叉分枝特性, 有些学者认为银杏与真蕨类植物的瓶尔小草属(Ophioglossum)存在密切的亲缘关系(Maekawa, 1948)。但从气孔结构(图 1)来看, 瓶尔小草(Ophioglossum vulgatum)的气孔器为无规则型(焦瑜等, 1999), 叶籽银杏的为单环型, 2种植物存在明显的区别。从气孔副卫细胞的个数来看, 叶籽银杏气孔副卫细胞数4~7个, 而分布在我国的所有苏铁属(Cycas)植物气孔副卫细胞数7~17个(王玉忠等, 1995), 两者之间差别较大。值得注意的是, 叶籽银杏某些叶生拟胚珠叶片下表皮气孔沿叶脉排列成不规则的气孔行, 与科达类以及松杉类极为相似。这一发现不仅从解剖学方面为银杏与松杉类有较近的亲缘关系提供了新的证据, 同时也说明了叶籽银杏的原始性, 因为这是某些古银杏类植物气孔的特征(吴舜卿等, 1980; Zhou et al., 1989), 而在银杏中也未发现有这种呈行排列的气孔(李正理等, 1989; 贺晓等, 1997; 陈立群等, 2004;Kanis et al., 1963; Kausik, 1974; Pant et al., 1964)。

综上所述, 无论从叶的解剖特征, 还是气孔特性来看, 叶籽银杏都处于比较原始的地位。而傅德志等(1993) "苞鳞-种鳞复合体" (bract-scale and seed-scale complex)概念和演化理论的提出, 标志着银杏这一类群已远较苏铁特化, 并应和具苞鳞-种鳞复合体的裸子植物(球果类)更接近。根据对叶籽银杏叶片解剖和气孔特性的研究, 作者支持上述观点, 即叶籽银杏和苏铁可能没有直接的亲缘关系, 而是两者在各自的演化线上平行发展; 但叶籽银杏和松柏类植物也许起源于同一分支, 而朝着不同的方向演化。周志炎(2003)认为中生代银杏沿着叶片扁化、蹼化和融合, 胚珠器官简化, 胚珠增大、数目减少, 珠柄趋于消失的趋势演化。而银杏雄球花的演化趋势也是小孢子囊数目的减少和小孢子叶长度的缩短(Liu et al., 2005)。银杏的叶生拟胚珠式样, 也许代表银杏类植物一种早期的大孢子叶式样, 为古银杏植物简单的可育性叶向现生银杏高度变态的总柄先端的结实结构演化的一种过渡式样。