‘新世纪’(Shinseiki)梨是日本培育的沙梨(Pyrus pyrifolia)的优良品种(梁林平等, 2001; 杨健等, 2001)。近年来中国、日本、韩国利用‘新世纪’梨进行杂交选育了许多优良品种，并广泛地栽培利用，这些品种都属于沙梨系统。沙梨是配子体自交不亲和品种，生产上常采用配置授粉品种或人工授粉等方法来克服自交不亲和性(佐藤昭宏, 2001)。自交不亲和梨品种无论配置授粉品种或人工授粉，均要考虑品种间的亲和性。而品种间的亲和性和S基因型间存在密切联系，即S基因型相同，则为自交不亲和，否则为自交亲和(Saito et al., 1999; Sassa et al., 1993; Ishimizu et al., 1996)。因此，梨品种S基因型的鉴定，对授粉品种配置、人工授粉以及梨的遗传改良及栽培利用具有一定的指导意义。国内外对梨自交不亲和性方面进行了大量的研究，目前已分离鉴定了35个S等位基因，确定了80多个品种的S基因型(谭晓风等, 2005a; 2005b;乌云塔娜等, 2005; 2006a; 2006b; Saito et al., 1999; Sassa et al., 1993; 1997；Ishimizu et al., 1996; 1999a; 1999b; Norioka et al., 1995; 1996; Shin et al., 1995; Kim et al., 2002; Ushijima et al., 1998)。日本通过分子生物学方法已经确定‘新世纪’梨的S基因型，为S₃S₄(佐藤昭宏, 2001)。梨的自交不亲和性由单基因位点控制，遵循孟德尔分离规律，故‘新世纪’梨的后代品种应该含有S₃基因和S₄基因中的一个。因此，本文选用13个‘新世纪’梨后代品种，分别用S₃和S₄基因特异内切酶切割，确定各品种的一个S基因，而另一个S基因通过PCR片段的回收测序来确定。这些品种S基因型的确定为沙梨授粉品种配置及人工授粉提供重要的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

1) 植物材料  ‘新世纪’、‘黄冠’等14个梨品种叶片采集于郑州果树研究所，样品及亲本见表 1。采集叶片2 g左右，保存于-80 ℃备用。

2) PCR引物   梨S基因由5个保守区、1个高变区及1段内含子组成。梨S等位基因的多态性主要来自于高变区(HV)的变异，通常根据高变区的不同来确认不同的S等位基因。引物设计在S基因高变区周边(图 1)。引物由上海基康有限公司合成。引物序列分别为：P1(FTQQYQ): 5′-TTTACGCAGCAATATCAG-3′；P2(IIWPNVV): 5′-AC(A/G)TTCGGCCAAATAATT-3′。

3) 药品试剂  PCR相关试剂购自大连宝生物技术有限公司，限制酶购自上海生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1) 梨叶DNA的提取、纯化，纯度和浓度测定  梨叶DNA的提取采用CTAB法(乌云塔娜等, 2003)，DNA纯化采用饱和酚纯化法(乌云塔娜等，2003)，纯度和浓度测定采用DU-640核酸蛋白分析仪。

2) PCR扩增反应体系和循环条件  PCR扩增反应体系和循环条件与谭晓风等(2005b)基本相同。

3) 酶切检测  选用‘新世纪’梨的杂交优良后代品种。‘新世纪’梨的S基因型为S₃S₄(佐藤昭宏, 2001)，按照孟德尔分离规律，‘新世纪’梨的后代一定含有S₃或S₄等位基因。首先利用S₄等位基因特异性限制酶来切割所有品种PCR产物，根据是否被切割和酶切片断大小来确定哪些品种含有S ₄等位基因。对不含S₄等位基因的梨品种PCR产物，再用S₃等位基因的特异性限制酶来切割，并根据是否被切割及切割片段大小来确定是否含有S₃等位基因。S₃和S₄等位基因的特异性限制酶切割片段大小见表 2。限制酶反应体系按说明书进行。产物检测用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，以100 bp的DNA ladder作分子质量参照物。

4) DNA序列测定  根据酶切鉴定13个梨品种的1个S等位基因后，另一个S等位基因通过DNA序列测定及生物信息学分析来确定。DNA序列测定时，首先用高保真酶PCR扩增供试品种的基因组DNA，并用S₃等位基因或S₄等位基因特异性限制酶来切割PCR扩增产物，回收未被酶切的370 bp左右(另一个S等位基因)的DNA片段进行纯化、DNA测序，并利用生物信息学软件进行相似性比较。DNA测序委托上海基康生物技术公司完成。

2 结果与分析 2.1 S基因特异引物PCR检测及酶切检测

供试的14个梨品种基因组DNA进行S基因特异性引物PCR扩增结果表明，14个梨品种均扩增出1条370 bp左右的DNA扩增片段，难以分离2个S等位基因(图 2)。

由于‘新世纪’梨的S基因型为S₃S₄，供试品种均为‘新世纪’梨的后代，因此这些‘新世纪’梨的后代品种中含有S₃等位基因或S₄等位基因，因此首先利用S₄等位基因特异酶NdeⅠ切割供试的14个梨品种S基因特异PCR产物。结果表明：黄冠、雅青、壁山二号、新雅、脆绿、西子绿、中梨二号、中梨一号、清香、青花10个品种PCR产物被NdeⅠ切割，且酶切产物大小与‘新世纪’梨S基因产物被NdeⅠ切割情况一致，大小在140 bp左右和228 bp左右(图 3)，因此可确定以上10个品种含有S₄等位基因。

另外3个品种新杭、翠冠、早美酥未被NdeⅠ切割，可能含有S₃等位基因，因此将这3个品种的PCR产物，用S₃等位基因的特异性限制酶PpuMⅠ进行切割。结果表明新杭、翠冠、早美酥均被 PpuMⅠ切割，且酶切产物大小与‘新世纪’梨S基因PCR产物被Ppu MⅠ切割情况一致(图 4)，大小在107 bp和270 bp左右，因此可以确定新杭、翠冠、早美酥含有一个S₃等位基因。

通过NdeⅠ和PpuMⅠ切割，可以确定黄冠等13个品种的1个S等位基因(表 3)。

2.2 另一个S等位基因的DNA测序鉴定

DNA序列分析结果表明：用P1和P2可扩增出S基因保守区1和2、HV区、内含子、2条引物序列及外显子序列(图 5、图 6)。序列相似性比较表明：黄冠、翠冠、早美酥、雅青、壁山二号、新杭、脆绿、西子绿、中梨二号、中梨一号、清香、新雅、青花的另1条S等位基因产物分别与S₁₆、S₅、S₃₅、S₁₇、S₁₆、S₁、S₃、S₁、S₃₁、S₃₅、S₇、S₁₇、S₁等位基因相似性达100%(图 5、图 6)。因此，它们分别含有S₁₆、S₅、S₃₅、S₁₇、S₁₆、S₁、S ₃、S₁、S₃₁、S₃₅、S₇、S₁₇、S₁等位基因。

3 结论与讨论

通过分子生物学和生物信息学方法鉴定了‘新世纪’梨后代13个优良品种的S基因型，黄冠、翠冠、早美酥、雅青、壁山二号、新杭、脆绿、西子绿、中梨二号、中梨一号、清香、新雅、青花等品种的S基因型分别为S₄S₁₆、S₃S ₅、S₃S₃₅、S₄S₁₇、S₄S₁₆、S₁S₃、S₃S₄、S₁S₄、S₄S₃₁、S₄S₃₅、S ₄S₇、S₄S₁₇、S₁S₄。

本文选用的13个梨品种均为‘新世纪’梨的杂交优良后代。梨自交不亲和性是属于配子体自交不亲和性，其特点为被单个S位点的复等位基因所控制，遗传模式上遵循孟德尔分离规律。‘新世纪’梨的S基因型为S₃S₄，因此以‘新世纪’梨为亲本进行杂交后获得的后代一定含有S₃或S₄等位基因。故本文利用‘新世纪’梨的S基因型，与它具有亲缘关系的梨品种为试验材料，首先确定是否含有S₄等位基因(NdeⅠ比PpuMⅠ便宜)，结果表明黄冠、雅青、壁山二号、新雅、脆绿、西子绿、中梨二号、中梨一号、清香、青花10个品种含有S₄等位基因。然后对不含S₄等位基因的梨品种新杭、翠冠、早美酥，用S₃等位基因的特异性内切酶来切割，结果表明这3个品种含有S₃等位基因。13个梨品种的另外1条等位基因回收测序后在GenBank中进行Blast，结果表明，测序的序列均可以在GenBank中找到，这样可以成功地鉴定13个梨品种的S基因型。

13个梨品种的亲本基因型有的已被确定，如雪花(S₄S_{1 6})、幸水(S₄S₅)、鸭梨(S₁S₁₇)，而其他亲本品种的S基因型的研究鲜见报道，故难以通过亲缘关系来进一步验证这13个梨品种的S基因型。但可以利用本研究结果推测出亲本的S等位基因，如早美酥S基因型为S₃S₃₅，亲本为‘新世纪’(S₃S₄)×早酥，按照孟德尔遗传规律早美酥的S₃等位基因来自于‘新世纪’梨，而另一个等位基因S₃₅来自于早酥，故早酥一定含有S₃₅等位基因；中梨一号(S₄S₃₅)的S基因型也证明了这一点。中梨二号S基因型为S₄S₃₁，其中S₄等位基因来自于‘新世纪’梨，S₃₁等位基因来自于大香水，故大香水应该含有1个S₃₁等位基因；同理可以推测三花含有1个S₇等位基因，台湾横山梨含有1个S₁等位基因。从新杭(S₁S₃)可以推测出杭青含S₁等位基因，从脆绿(S₃S₄)推测出杭青的另一个S等位基因可能为S₃或S₄。