植物病毒病给农业生产造成极大的损失。据统计，全世界每年仅烟草花叶病毒(tobacco moscaic virus，TMV)造成的损失就达1亿美元以上(吴云峰，1995)。植物是天然药物的宝库，国内外学者对植物中抗病毒活性物质进行了广泛深入的研究(侯玉霞等，2000；李重九等，1997；French et al., 1991; Fredrich et al. 1996)，发现了一些对TMV有较好效果的抑制剂。目前，国内外对于植物活性成分的研究主要为对次生代谢物质的研究。

核桃(Juglans regia)是胡桃属植物中经济价值最高的一种，在我国栽培历史悠久，分布广泛。据报道，核桃叶次生物质对蚜虫、粘虫、杨毒蛾具有较好的触杀和胃毒效果(翟梅枝等，2003a; 2001; 2005)，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等具有较好的抑制作用(翟梅枝等，2003b)，但核桃叶抗植物病毒活性方面未见报道。本研究采用不同溶剂和提取方法对核桃叶中次生物质进行提取，利用活性跟踪手段测定其抗TMV活性，并进行核桃叶中抗病毒活性物质提取条件的优化，研究结果可望为核桃叶的综合利用和植物源抗病毒剂的开发提供科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1) 植物样品  核桃叶采自西北农林科技大学核桃采穗圃内，自然晾干后，在45 ℃左右的烘干箱中烘干，粉碎过20目筛(孔径0.84 mm)，然后密封于塑料袋内，置冰箱中备用。

2) 寄主植物  选用普通烟K326 (Nicotiana tabacum cv. K326)和心叶烟(N. glutinosa)为寄主植物，前者为TMV的系统侵染寄主，用于病毒的繁殖；后者为TMV的局部枯斑寄主。

供试烟苗均采用直播漂浮育苗技术进行培育，经50 d水培后，将幼苗移入直径15 cm的花盆中土培，生长一定时间后，选长势一致的幼苗用于病毒接种试验。

3) 供试病毒  烟草花叶病毒普通株系，保存在普通烟K326植株上，提纯后备用。

4) 主要仪器及试剂  主要仪器有RE52A旋转薄膜蒸发仪、循环水真空泵、751型分光光度计、高速离心机、植物粉碎机、恒温水浴锅等；试剂有乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、聚乙二醇、二甲基亚砜等，均为分析纯。

1.2 方法

1) 核桃叶中次生物质的提取  在提取时间3 h、料液比[质量(g)体积(mL)比]10/150条件下，用体积分数95%乙醇、甲醇和水作溶剂，采取3种不同的提取方法，提取核桃叶中的次生物质，以半叶法接种心叶烟，根据提取物对TMV的抑制效果确定适宜的提取溶剂和方法。

① 索氏提取  称取样品20 g，加入折叠好的脱脂滤纸，装入索氏提取器中，用不同溶剂在水浴中加热连续提取一定时间，过滤提取液，滤液减压浓缩得提取物W₁。

② 回流提取  称取样品20 g置于圆底烧瓶中，用不同的溶剂进行回流提取，过滤提取液，滤液减压浓缩得提取物W₂。

③ 冷浸提取  称取样品20 g置于烧杯中，用不同提取溶剂于室温下浸泡一定时间后过滤，滤液减压浓缩得提取物W₃。

2) 萃取物、分离物的制备  以95%乙醇冷浸提取的核桃叶粗提物悬浮于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂萃取分离，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余水相；乙酸乙酯萃取物经聚酰胺柱层析分离得30%、50%、70%乙醇洗脱物质，选择活性高的洗脱物质上硅胶柱和Sephadex LH-20柱纯化得到化合物A。

3) 核桃叶中抗病毒活性物质提取条件优化  以乙醇浓度、提取时间和料液比为因素，设置3因素3水平L₉(3³)正交试验，冷浸提取核桃叶中的抗病毒活性物质，根据活性跟踪结果确定适宜的提取条件。试验因素及水平见表 1。

4) TMV病毒的提纯  烟草花叶病毒经心叶烟纯化后，在普通烟K326上繁殖。TMV的提纯参考Gooding等(1967)的方法，略有修改，其中在第一次加入聚乙二醇(PEG)之前采取2次离心的方法，离心速度为5 000 r·min^-1，每次30 min，其他步骤不变。

5) 病毒接种液的配制  取一定量样品提取液，加入少量DMSO溶解后，加蒸馏水稀释至1 mL，接种前加入提纯病毒液，使提取液中病毒的终浓度为20~30 μg·mL^-1，混合均匀后用于接种，以不含样品提取物的相同浓度病毒溶液为对照接种液。

6) 抗病毒活性的测定  采用半叶法混合接种。选择健康、生长旺盛的6~8叶期心叶烟，左半叶接种含有TMV的植物样品提取液，右半叶接种对照液。每处理接种4~5个叶片，重复3次，3 d后分别统计枯斑数目，抑制率计算公式为：

2 结果与分析 2.1 提取溶剂和方法对核桃叶提取物抗TMV活性的影响

在提取时间(3 h)、料液比(10/150)一定时，3种不同提取方法所得提取物抗TMV活性跟踪测定结果(表 2)表明：用水作为溶剂提取时，提取物对TMV的抑制率仅为60%左右，而甲醇和体积分数95%乙醇作溶剂提取时，抑制率都在75%以上；95%乙醇作为提取溶剂，回流提取、索氏提取所得提取物对TMV的抑制率分别为86.68%、93.25%；冷浸提取所得提取物对TM V的抑制率最高，为100%，即完全抑制了病毒的混合侵染。这可能是由于乙醇冷浸提取物中所含杂质相对较少、活性物质多且各成分间协同增效作用所致。

由表 2还可看出：提取方法相同时，95%乙醇提取物抑制效果好于甲醇提取物和水提取物的抑制效果；提取溶剂相同时，冷浸提取物抑制效果最好，其次为索提提取物，回流提取物抑制效果最差。因此，从提取物的抗TMV活性和溶剂的安全性、实用性等来考虑，核桃叶中抗TMV活性物质的提取以95%乙醇溶液冷浸提取较好。

2.2 核桃叶提取(萃取、分离)物对TMV的抑制效果

核桃叶提取(萃取、分离)物对TMV侵染心叶烟的抑制效果见表 3。由表 3可看出，在供试质量浓度为5 mg·mL^-1时，95%乙醇冷浸提取物对TMV侵染心叶烟的抑制率仍为100%。在冷浸提取物的各萃取物、分离物中，乙酸乙酯萃取物和化合物A对TMV浸染心叶烟的抑制率都在85%以上，分别为86.91%和85.55%；各萃取物在供试质量浓度为1 mg·mL^-1时，对TM V浸染心叶烟的抑制率作用大小依次为：乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞萃余水相。乙酸乙酯萃取物经多次聚酰胺柱层析分离得到的3个不同洗脱流份中，30%乙醇洗脱物质对TMV侵染心叶烟的抑制率最高，为72.37%。该洗脱物经Sephadex LH-20柱纯化得到化合物A，活性检测表明：A物质对TMV侵染心叶烟具有较好的抑制效果，抑制率达85.55%，说明化合物A是乙酸乙酯萃取物中的主要抗病毒活性成分之一。

2.3 核桃叶中抗TMV活性物质提取条件的优化

由正交试验结果(表 4)的直观分析可以看出：1) 3个试验因素对活性物质抗TMV抑制率的影响顺序依次为：乙醇浓度＞提取时间＞料液比。即乙醇浓度为影响提取物抗TMV活性的主要因素。所以，进行核桃叶中活性物质的提取时，必须将乙醇浓度控制在最优水平上，对于次要因素则可在一定范围内选取适当的水平。2)核桃叶中活性物质提取的适宜条件为A₂B₃C₂和A₂B₂C₁，这2种组合所得的提取物，对TMV的抑制率分别为100%和99.99%。但两者的提取物得率因料液比、提取时间不同差异较大，A₂B₃C ₂组合提取18 h，得率为21.42%；A₂B₂C₁组合因料液比小于A₂B₃C₂组合，且提取短(12 h)，得率仅为10.68%，前者的提取得率为后者的2.01倍。综合考虑提取时间、料液比和提取物得率等因素对活性成分的影响，选择A2B3C2作为核桃叶中抗TMV活性物质提取条件的最优组合。即以95%乙醇为提取溶剂，料液比20/200(1:10)，冷浸18 h，所得活性物质对TMV抑制作用最强，且提取物得率较高。

3 小结与讨论 3.1 小结

1) 同一植物材料因提取溶剂、提取方法不同，所得活性物质对TMV侵染心叶烟的抑制效果不同。核桃叶中抗TMV活性物质的提取以95%乙醇溶液冷浸提取较好。

2) 核桃叶的95%乙醇冷浸提取物经萃取分离和活性跟踪显示，各萃取物中对TMV侵染心叶烟的抑制作用大小依次为：乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞萃余水相；乙酸乙酯萃取物经柱层析分离、纯化和重结晶得到化合物A，A物质对TMV侵染心叶烟具有较好的抑制效果，抑制率达85.55%。

3) 采用冷浸提取时，核桃叶中抗TMV活性成分提取的优化条件是：95%乙醇为提取溶剂，料液比20/200(1:10)，提取18 h。

3.2 讨论

1) 活性物质的提取  一植物材料用不同的提取溶剂提取，所得提取物的抗烟草花叶病毒活性有一定差异；当提取溶剂相同时，因提取方法的不同所得提取物的抗病毒活性也有一定的差异。乙醇是活性成分提取中最常用的溶剂，其毒性小、价格便宜、浓缩回收方便；以水为溶剂，虽然成本较低，但提取物中其他杂质含量较多，且水提取物浓缩困难、易腐败变质；而甲醇有毒、污染严重，故试验中尽量少用。因此，从经济和安全的角度来看，选择乙醇为溶剂提取核桃叶中具有抗病毒活性的次生物质较适宜。活性物质提取中最常用的方法有冷浸法、回流法和索氏提取法。回流法和索氏提取时，都有可能因材料持续受热时间过长，破坏材料中的非耐热活性成分，导致所得提取物的抗病毒活性下降。因此，在进行活性物质的提取时，特别是当活性成分耐热性差时，宜选用冷浸法。

2) 活性组分的分离  核桃叶的乙醇提取物具有成分复杂，所含物质种类多的特点，以不同溶剂(极性依次由小到大：石油醚、乙酸乙酯和正丁醇)对乙醇提取物进行初步分离，可将其大致分为3个极性不同的部分，有利于活性成分的进一步跟踪分离。本研究获得的化合物A只是乙酸乙酯萃取物中的抗病毒活性成分之一，结构正待鉴定。核桃叶中的其他抗病毒活性成分正在深入研究中。