南华松叶蜂(Diprion nanhuaensis)属膜翅目(Hymenoptera)广腰亚目(Symphyta)叶蜂总科(Tenthredinodea)松叶蜂科(Diprionidae)松叶蜂属(Diprion)，是近年来危害我国松树的重大害虫之一。主要发生在海拔2 000~2 600 m的云南松(Pinus yunnanensis)林内(萧刚柔等, 1991; 周淑芷等, 1994), 幼虫取食针叶的叶肉或全叶，危害严重时针叶几乎全部被吃光，严重影响树木的生长和发育，亦可导致部分植株枯死。在云南省，祥云新松叶蜂(Neodiprion xiangyunicus)、南华松叶蜂(Diprion nanhuaensis)、会泽新松叶蜂(N. huizeensis)、楚雄腮扁叶蜂(Cephalica chuxiongnica)等从1988年至今一直严重危害云南(赵秉义等，1998)。目前，我国防治该类害虫主要采用化学防治，而化学防治不仅杀伤天敌、污染环境，还使害虫产生了抗性，导致害虫呈周期性频繁发生，最终不能可持续控制害虫，所以寻找致病力强的病原对该类害虫进行生物防治显得尤为重要。

笔者在云南楚雄对松叶蜂病原微生物进行采集，发现了一种南华松叶蜂病毒，现将其鉴定结果，以及对祥云新松叶蜂和南华松叶蜂的感染研究报道如下。

1 材料与方法 1.1 南华松叶蜂死虫来源、病毒的初鉴定及分离

1) 死虫来源   2005年10月中旬在云南楚雄采集4~5龄南华松叶蜂的老熟幼虫，并带回实验室饲养，4 d后开始死亡，6~7 d后大量死亡，10 d后全部死亡。2)病毒的初鉴定  取少许死虫脓液涂在干净的薄片上，采用伊红染色法(什维佐娃染色法)和次甲基蓝染色法染色，油镜下观察。3)病毒的分离  ①收集以上死虫，经表面消毒处理后加入适量无菌水研磨，用两层纱布中央加一薄层脱脂棉过滤，滤液与死虫的体积比约为10:1。②先将滤液在4 ℃、8 000 r·min^-1下离心30 min，弃上清液留沉淀，以上程序重复3次。③无菌水悬浮沉淀，4 ℃、500 r·min^-1下离心5 min弃沉淀留上清；4 ℃、800 r·min^-1下离心3 min弃沉淀留上清；4℃、1 000 r·min^-1下离心3 min弃沉淀留上清；4 ℃、1 500 r·min^-1下离心2 min弃沉淀留上清。④最后将上清液合并，4 ℃、10 000 r·min^-1下离心40 min，收集沉淀，将所得到的沉淀用适量的无菌水悬浮后(沉淀:无菌水约为1:5)静置。

1.2 电镜观察

1) 病毒多角体形态的电镜观察  将离心后收集到的病毒用适量的无菌水悬浮成溶液，涂于干净的载玻片上，自然干燥，喷金，DMS-6360LZ型扫描电镜观察。2)病毒多角体超薄切片的制备及电镜的观察   ①取米粒大小的南华松叶蜂病毒样品置于1.0 mL的离心管底部，用2%戊二醛固定6 h，然后用pH=6.8的磷酸缓冲液清洗2~3次、在4 ℃冰箱中过夜。②用2%的锇酸固定1.5 h，pH=6.8的磷酸缓冲液清洗2~3次，在4 ℃冰箱中过夜。③然后在4 ℃冰箱中用体积分数70%、80%、95%的酒精逐次脱水各15 min后，再用体积分数100%的酒精脱水2次、各10 min，丙酮脱水1次、10 min。④用环氧树脂Epon812浸透包埋，于35、45、60 ℃中分别聚合12、24、48 h。⑤最后用ULTRACUT型超薄切片机切片，切片厚度为50~60 nm, 经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，在JEM1230型透射电镜下观察。

1.3 南华松叶蜂病毒毒力测试

1) 室内感染2~3龄祥云新松叶蜂幼虫试验  用适量无菌水悬浮离心所得南华松叶蜂病毒备用，微生物记数器计数浓度为3.9×10⁸ PIB·mL^-1，设空白为对照。挑选2~3龄取食活泼的健康幼虫为试虫，试验前采集新鲜的油松枝条，用蒸馏水清洗干净，晾干后用毛笔涂抹南华松叶蜂病毒于松针上，等松针上的病毒溶液自然干燥后和幼虫一起放入干净的玻璃养虫缸内(圆柱形, 10 cm×15 cm)。每缸放入幼虫40头，用白纱布罩住，处理及对照各重复2次。处理后放置在25 ℃和相对湿度在70%~80%下的恒温培养箱中，每3 d换1次新鲜松叶，每隔2 d定时检幼虫的死亡情况，观察死亡状况，并做记录，拣出死虫，解剖死虫后取出组织脓液，丙酮处理后伊红染色法(什维佐娃染色法)和次甲基蓝染色法染色，镜检感染情况。2)室内感染5~6龄祥云新松叶蜂幼虫试验  挑选健康的祥云新松叶蜂5~6龄幼虫作为试虫(30头)，浓度为3.9×10⁸ PIB·mL^-1，试验重复2次。在15~20 ℃室温下沙埋试验过程中幼虫结的虫茧，观察其羽化率，其他试验方法和条件同上。3)室内感染2~3龄南华松叶蜂幼虫试验悬浮南华松叶蜂病毒，配制其为2.0×10⁸、2.0×10⁷ PIB·mL^-1 2浓度，试验条件和方法同上。试验重复3次。

1.4 数据分析

采用Excell和SPSS统计分析软件。

2 结果与分析

适量无菌水悬浮离心所得沉淀，静置数日后容器底部出现灰白色物质，在光学显微镜下观察，灰白色物质的悬浮液中有大小均匀的小颗粒，液体状态下病毒多角体呈同心圆并做布朗运动。伊红染色后油镜下观察小颗粒呈粉红色，即初步鉴定该灰白色物质为核型多角体病毒。

2.1 南华松叶蜂病毒的形态特征

1) 扫描电镜观察结果  南华松叶蜂多角体病毒表面平坦，形状为多面体结构，近似圆球形，直径在0.5~1.0 μm之间，少数形状不规则(图 1)。2)透射电镜超薄切片观察结果  透射电镜的观察表明(图 2)：该病毒为核型多角体病毒，多角体切片在透射电镜呈圆形，少数为不规则形状，病毒粒子呈杆状，为单核衣壳多角体类型(单粒包埋single nucleocapsid polyhedrosis virus，SNPV)，没有发现多核衣壳多角体类型(多粒包埋multiple nucleocapsid polyhedrosis virus，MNPN)；一个多角体包涵体中有多个病毒粒子，极少数为1个，6个的居多；杆状病毒粒子两端平截，大小大约为(20~25)nm×(125~200)nm，在多角体中零散分布，排列方式无规律。

2.2 病毒鉴定

根据伊红染色多角体呈粉红色，电镜观察包涵体为不规则的多面体、近球形，病毒粒子杆状等一系列特征，参照国际病毒分类和命名原则(吕鸿声, 1982)，这株病毒属于无脊椎动物病毒中的杆状病毒科(Baculoviridae)杆状病毒属(Baculovirus) A亚组(Baculovirus subgroup A)的一个种，定名为南华松叶蜂核型多角体病毒(Diprion nanhuaensis nuclear polyhedrosis virus, DnNPV)。

2.3 对祥云新松叶蜂低龄幼虫的感染致死作用

祥云新松叶蜂幼虫感染该病毒后的试验结果见表 1和表 2。对表 1中总校正死亡率和对照进行μ测验，发现祥云新松叶蜂感染DnNPV(浓度为3.9×10⁸ PIB·mL^-1)16 d后，校正死亡率和对照在P＜0.01显著水平上呈极显著；表 2中接毒处理组中死亡虫数为3，接茧数为27，对照组中死亡虫数为3，接茧数为27，同时发现沙藏的虫茧全部羽化。即：DnNPV对祥云新松叶蜂2~3龄幼虫有一定的致死作用。

2.4 对南华松叶蜂2~3幼虫的感染致死作用

对表 3中的累计死亡率逐日进行多重比较分析，结果发现：处理1(2.0×10⁸ PIB·mL^-1)从第4天起到第10天，与对照在p＜0.05显著水平上呈极显著差异；处理2从第4天起到第6天内，与对照在p＜0.05显著水平上均存在显著差异, 从第6天起到第10天内与对照在p＜0.05显著水平上呈极显著差异。DnNPV对南华松叶蜂2~3龄幼虫有一定的致死作用。

3 结论与讨论

根据王用贤等(1993)的报道，在云南昆明呈贡县云南松林中采集到的自然罹死的2~3龄南华松叶蜂虫体上分离到的南华松叶蜂NPV，在电镜观察下病毒粒子为单粒包埋，多角体直径大约为0.4~2.4 μm，病毒粒子大小约为76 nm×307 nm。昆明分离到的多角体直径和病毒粒子大小与本研究从楚雄分离得到的多角体直径和病毒粒子大小有较大的差距，楚雄分离到的多角体直径大约为0.5~1.0 μm，病毒粒子大小大约为(25~30)nm×(125~200)nm。所以，以上2地的南华松叶蜂NPV是否为同一种病毒有待于生化技术的分析鉴定。

因本次试验中所得南华松叶蜂病毒数量有限，未进行蔗糖梯度离心，如果要对该病毒的其他特性进行深入的探讨和研究，还需要进行蔗糖剃度离心得到纯净的病毒。该病毒对祥云新松叶蜂低龄幼虫有一定的感染致死作用，对高龄的祥云新松叶蜂幼虫没有致死作用，原因可能是大龄幼虫的抵御机制较强，也可能是该病毒对大幼虫感染的诱发条件不充分，也有待近一步的试验验证。

本次试验发现：DnNPV对祥云新松叶蜂2~3龄幼虫和南华松叶蜂2~3龄幼虫钧有一定的致病作用，这为我国松叶蜂利用病毒对其进行生物防治提供了宝贵的病原资源，而目前所得到的DnNPV数量非常少，有待对其进一步扩增。