五倍子是倍蚜虫寄生在盐肤木(Rhus chinensis)、红麸杨(R. punjabensis var. sinica)和青麸杨(R. potaninii)等的树叶上，刺激叶组织细胞增生膨大而形成的虫瘿。倍蚜属同翅目(Homoptera)，瘿绵蚜科(Pemphigidae)，五节根蚜亚科(Fordinae)；我国的倍蚜被划分为5属，14种(亚种)。其中角倍蚜(Schlechtendalia chinensis)是生产中利用最多的种。该蚜所形成的角倍，其产量约占我国五倍子总产量的75%(唐觉等，1957；向和，1980；张广学等，1999)。由于倍蚜体型微小，生活周期复杂，形态变异较大，其分类在学术界存在较大的争议(李治国等，2003)。RAPD技术能够简单、快速地检测生物间的遗传差异，其所需的DNA材料极少，对于研究蚜虫这样的微小昆虫十分有利(龚鹏等，2001)，RAPD技术已被应用于蚜虫的种类鉴定、生物型识别和遗传变异研究(Black IV et al., 1992)，但在倍蚜的研究方面，还没有相关的报道。

五倍子是生产可溶性单宁酸、没食子酸和焦性没食子酸等化工产品的重要原料，在医药、纺织、化工、食品、环保和农业等行业中用途广泛；我国五倍子产量约占世界总产量的95%，五倍子不仅是我国重要的资源昆虫产品和传统的出口商品，其寄主植物还有绿化荒山、保持水土的功效(赖永祺，1987)。因此，应用分子遗传标记技术，从DNA水平研究倍蚜的亲缘关系和种群分化，对于保护和合理利用这一生物资源具有重要意义。本研究采用RAPD技术，对11种倍蚜的亲缘关系和角倍蚜的4个地理种群间的差异进行了分析研究。

1 材料与方法 1.1 倍蚜样品采集与保存

供试倍蚜样品采集于四川、陕西、贵州和云南(表 1)；角倍蚜实验种群系春季从四川峨眉引进，在昆明温室接种到夏寄主盐肤木上，秋季倍子成熟后采集。为保证样品来自不同的克隆，在野外采集相隔1.5 m以上、接近成熟但尚未爆裂的倍子，带回室内打开，将孤雌胎生有翅或无翅成蚜转移到1.5 mL离心管中，无水乙醇浸泡，-20 ℃保存。采集的样本总数约200份，试验时随机抽取个体。

1.2 倍蚜基因组DNA的提取

从11种倍蚜和角倍蚜4个地理种群样品中抽取116份样品，采用修改后的蛋白酶K法提取倍蚜的基因组DNA (田英芳等，1999；杨子祥等，2005；2006)，测定DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖电泳检测DNA的完整性，-20 ℃保存备用。

1.3 DNA扩增

PCR反应体系为20 μL，其中含1×buffer，2.5 mmol·L^-1 MgCl₂，0.5 mmol·L^-1 dNTP (promega)，2U Taq酶(promega)，66 ng引物(上海Sangon)，1 μL模板DNA，加入ddH₂O至20 μL。扩增在MJ-PTC 200 DNA扩增仪上进行，条件为：94 ℃ 5 min，后进行40个循环，即94 ℃ 1 min、36 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，最后于72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃。在种间水平上，每个种扩增8~10头个体。在角倍蚜种群水平上，每个种群检测4个个体，用倍蛋蚜作外类群。

1.4 产物检测

将扩增后的DNA在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，上样量为2.0 μL，电压为3 V·cm^-1，时间为90 min，电泳缓冲液为1×TBE；0.05% EB染色，UVP GDS-8000凝胶成像系统观察、照相和分析。用GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (Fermantas)作为分子量的标准。

1.5 数据统计与分析

根据分子量大小对扩增结果读带，然后转变为可供计算机处理的0-1数据(分别表示特定位点上的有或无)。采用Popgene 1.31软件进行分析，计算遗传距离(D)和遗传一致性(I)，遗传距离反映2个群体在趋异进化过程中发生等位基因替换位点的比例，它代表所有位点上基因分化水平的平均值，不同位点在群体间的遗传距离各不相同；遗传一致性是指2个群体间完全一致的基因所占的比例(郑哲民等，2000)。在Mega 3.1软件中用非加权成组配对法(UPGMA)对群体进行聚类分析。

2 结果与分析 2.1 PCR反应体系的建立

为测试PCR反应体系的稳定性，先筛选出一条扩增条带清晰、多态性好的引物S7，对肚倍蚜指名亚种同一克隆4个个体的DNA进行扩增，用同一属的2个亚种和米倍蚜作对照。从图 1可以看出：4个个体的带型基本相同，分别在350、800、1 100和1 500 bp处各有4条清晰、明亮的条带。3个对照的带型是：肚倍蚜蛋铁亚种在350、1 100和1 500 bp与肚倍蚜指名亚种有共同的条带，但缺少800 bp的明亮条带；肚倍蚜蛋肚亚种在350和1 500 bp与肚倍蚜指名亚种有共同的条带，但缺少800、1 100 bp的条带；米倍蚜与3种肚倍蚜指名亚种之间只有350 bp的共同条带。这表明：只要引物合适，采用本PCR反应体系可以得到重复性和种间特异性较好的结果，以下的试验均采用此反应体系和条件。

2.2 DNA扩增产物的电泳结果和分析 2.2.1 11种倍蚜间的RAPD扩增结果

从40条引物中筛选出13条条带清晰、多态性较好的引物进行扩增，共扩增出了200个位点，多态位点率为100%，平均每条引物扩增出15.4个位点，片段大小为100~3 000 bp(表 2)。表明11种倍蚜之间具有非常丰富的DNA系列多态性。

电泳图谱显示：属间带型差异明显，共有条带较少；属内一般具有相同的主带，共有条带较多。如引物S103的扩增结果是角倍蚜和倍蛋蚜在400和1 100 bp有共同的条带，与肚倍蚜枣铁亚种没有共有带(图 2a)；引物S22的扩增结果是倍花蚜、红倍花蚜在400、550、900、1 200和1 400 bp有共同的条带，与肚倍蚜枣铁亚种仅在900和1 400 bp有共同的条带(图 2b)，这2个条带可以看作这2个属间的共有条带；引物S62的扩增结果是黄小铁枣倍蚜和米倍蚜在400、800、1 400和1 800 bp有共同的条带，与红小铁枣倍蚜在400、800 bp处有共同的条带(图 2c)，即本属的3个种有2条共有条带；引物S43的扩增结果是肚倍蚜指名亚种、肚倍蚜蛋肚亚种、肚倍蚜蛋铁亚种在600、900和1 300 bp有共同的条带(图 2d)。

2.2.2 角倍蚜4个不同地理种群的RAPD扩增结果

从40条引物中筛选出9个条带清晰、多态性较好的引物进行扩增，共扩增出了133个位点，其中多态位点36个，多态位点率为27.7%，平均每条引物扩增出14.7个位点，片段大小为250~2 800 bp(表 3)。

电泳图谱显示：角倍蚜4个地理种群具有非常相似的带型，它们与倍蛋蚜(外类群)的带型则明显不同。引物S48的扩增结果，4个地理种群在400、650和800 bp有共同的条带，仅在一些弱带上有差别(图 3)；倍蛋蚜(外类群)虽在400、650和800 bp处与角倍蚜有共同的条带，但800 bp处的条带亮度较弱，且在1 031、1 200和1 500 bp还有3个条带。

2.3 遗传距离和聚类分析 2.3.1 倍蚜种间遗传距离和聚类分析

从表 4看出：倍蚜种间的遗传距离介于0.064 1~0.726 9之间，平均值为0.425 2，可见11个种之间存在较大的遗传差异；其中遗传距离在不同属之间为0.482 8±0.170 8，不同种之间为0.252 0±0.178 0，不同亚种之间为0.147 2±0.076 4，在角倍蚜种群间为0.075 9±0.030 2(表 5)。随着分类地位的接近，遗传距离逐渐减小；其中肚倍蚜的4个亚种具有很高的遗传一致性，其平均遗传距离为0.149 6，远远小于11个种间的平均遗传距离0.425 2，这与将它们调整为种下分类单元的结论相符合(张广学等，1999)。

从聚类图(图 4)可以看出：11种倍蚜聚集成2类，圆角倍蚜属的倍花蚜和红倍花蚜聚集成1类，其余9种倍蚜聚集成另一类，反映了它们在虫瘿类型上的差异。倍花蚜和红倍花蚜的虫瘿具有多重分枝，整个倍体呈花状，其他9种倍蚜的虫瘿为枣状、梨状或球状，暗示它们可能存在不同的起源；此结果与Zhang等(1999)认为圆角倍蚜属是首先分化的类群相符合。在另一分支中，肚倍蚜蛋肚亚种和肚倍蛋铁亚种首先聚在一起，后依次和肚倍蚜指名亚种、肚倍枣铁亚种聚成1类，显示了它们极为相近的亲缘关系；黄小铁枣倍蚜和米倍蚜聚成1支，然后和红小铁枣倍蚜聚成1类，显示了它们同为同一属的亲缘关系；角倍蚜与倍蛋蚜在较远的分枝上聚在一起，表明它们虽属于同一个属，但遗传差异较大；上述9种倍蚜在聚类图上最终相聚，暗示着它们可能存在共同的起源。总体上看：倍蚜同属的各个种都聚集在一起，聚类结果与形态分类结果基本一致，即本研究从DNA水平上为倍蚜的现行分类体系提供了新的证据。

2.3.2 角倍蚜4个种群间的扩增结果

分析表明：峨眉种群与试验种群的遗传距离最小(0.035 5)，与陕西西乡种群和贵州湄潭种群的遗传距离依次增大(0.054 2和0.095 0)。这4个地理种群与外类群的遗传差异明显，其平均遗传距离为0.493 6(表 6)。Zhang等(2000)采用RAPD技术对蚜虫不同分类阶元的研究结果是种间的遗传距离为0.297 5 ± 0.062 7，同种的不同种群间为0.043 3 ±0.022 2。表 6说明角倍蚜4个种群间的遗传距离为0.075 9 ± 0.030 2，略大于同种的不同种群间的平均值，但小于种之间的平均值。表明角倍蚜的不同种群间存在着遗传分化，但其分化尚处于种群水平。

聚类图直观地显示了种群间的遗传差异和分化程度。峨眉种群与试验种群首先聚成一类，这与试验种群系从峨眉引种相符合，然后依次和陕西西乡种群和贵州湄潭种群相聚，最后才与外类群汇合(图 5)。可见角倍蚜的地理种群间已经出现了一定程度的遗传分化，造成这种分化的原因可能是地理上的隔离。陕西、四川、贵州和云南是我国倍蚜的起源和分布中心(张广学等，1999)，其最初的分布可能是连续的，后来由于气候和寄主分布的变化，使得角倍蚜的分布不再连续，基因交流受阻，种群间产生了分化。四川与陕西接壤，其种群分化较晚，因而遗传差异较小，而贵州湄潭与陕西西乡距离较远，种群分化较早，其间还有长江的阻隔，因而遗传差异较大。

3 结论与讨论 3.1 分子数据与形态数据的结果基本一致

从RAPD研究结果看，倍蚜4个属间的差异明显(其平均遗传距离为0.482 8)，这与形态分类的结果基本一致。但属下各种的亲缘关系的分子数据与形态分类并不完全一致，除倍蚜属外，另外3个属内的各个种间的遗传差异较小；圆角倍蚜属的倍花蚜与红倍花蚜的遗传距离为0.064 9，小铁枣蚜属的黄小铁枣倍蚜与米倍蚜的遗传距离分别为0.076 2，并在聚类图上先后聚成了1类，显示它们之间很近的亲缘关系和较高的遗传一致性，参照铁倍蚜属的分类模式和前人的研究结果(张广学等，1999；Zhang et al., 2000)，将它们分别调整为种下分类单元似乎更为合理。

3.2 倍蚜对夏寄主树的选择与其亲缘关系没有明显的相关性

在传统的倍蚜分类中，夏寄主的不同是倍蚜分类的依据之一，并把寄生于盐肤木上的虫瘿称为“角倍”，寄生于红麸杨和青麸杨上的分别称“铁倍”和“肚倍”(赖永祺，1987)，但这种差异在RAPD分析时并不明显。黄小铁枣倍蚜和米倍蚜的夏寄主树分别为红麸杨和青麸杨，但在聚类图上聚成了1类，其遗传一致性为0.929 6，相似性较高，它们也许只是同1个种的2个寄主专化型。相反，角倍蚜和倍蛋蚜的夏寄主树都是盐肤木，却没有聚成1类，它们的遗传一致性只有0.638 2，可见对夏寄主树的选择与倍蚜种间亲缘关系没有明显相关性。

3.3 角倍蚜种群的分化较为明显

角倍蚜4个不同地理种群间具有较高的DNA序列多态性和种群分化，其生物学和繁殖习性有助于保持种群间的遗传分化特性。在年生活史中需要冬、夏2类寄主，在夏寄主上形成五倍子；在其生活周期中，雌雄性蚜交配后，每头雌蚜只产1头干母，干母爬到夏寄主树上寄生形成虫瘿(倍子)，并在虫瘿内营孤雌生殖(张广学等，1983)，这种有性世代与无性世代，两性生殖与孤雌生殖交替的生活方式，使倍蚜的遗传特性不致于因为大量的孤雌生殖而丧失，保持了种群内遗传多样性的稳定性。

3.4 RAPD技术在倍蚜研究中的价值

形态分类直观、简便，容易操作，仍是各种分类技术中的主导技术。但是，倍蚜微小、形态变异大，仅凭形态特征分类常有较大的困难。物种进化的本质是基因的进化，以分子技术来研究倍蚜的亲缘关系和分类比形态技术有优越性。RAPD技术具有很高的敏感性，能检测出倍蚜种群间的微小差异，因而非常适合于进行相似种的识别和种群分化的研究。但本研究仅仅考虑了扩增条带的位置和有无，忽略了其他一些信息；倍蚜分类只有综合应用形态学、细胞学和分子遗传标记技术，才能全面地反映其遗传变异和系统发育关系。