曼地亚红豆杉(Taxus media ‘Hecksii’)又称直立杂种紫杉，是美国于1918年发现的以欧洲红豆杉(T.baccata)为父本与东北红豆杉(T.cuspidata)为母本的一个天然杂交种(张照喜，2005)。多为常绿灌木，主根不明显，侧根发达，萌发力强，耐修剪，耐寒，能耐-25 ℃以下低温，生长速度快，对环境适应性强。实测年高为国内红豆杉的3~7倍，生长优势明显。3~4 a生物量积累为300~400 g·株^-1a^-1，5年生时产干原料1 kg·株^-1(蒲春林等，2005)。曼地亚红豆杉紫杉醇含量高且稳定，为0.03%~0.06%，是中国红豆杉品种含量的8~10倍(王占和，2005)。且可全株利用，枝叶含量可达0.046%，相当于一般红豆杉属植物干树皮含量的2~4倍(李守玉，2005)。经比较研究认为曼地亚红豆杉是筛选出的紫杉醇含量高的优良种(毛锁云等，2002)。因而进行曼地亚红豆杉快繁育苗技术体系的研究意义重大。目前对红豆杉的研究主要集中在：细胞培养(刘佳佳等，1999)、发酵培养(陈毅坚等，2003)、化学合成(邓先珍等，2002)、遗传转化(李云等，2003)等方面。虽都取得了一定的试验进展，但都还未达到商业化生产的要求。而且无论是直接提取还是半合成，均离不开其资源植物红豆杉(张钢民等，1998)。因而解决紫杉醇的需求问题只能依靠快繁育苗发展药用原料林。目前生产上主要采用扦插繁殖来培育红豆杉，而对红豆杉组织培养快繁育苗的研究还未见系统报道。以东北红豆杉芽苞和茎尖为外植体，在添加6-BA和NAA的培养基上能诱导芽的发生和生长，将芽体转到含IBA的生根培养基上，2月后可诱导不定根的发生。但生根时间长，生根率低(程广有等，2000)。红豆杉属植物能获得较高的愈伤组织诱导率(刘涤等，1997；李景原等，1997；马均等，2006)，但愈伤组织的再分化困难(刘丽萍等，1998)，以云南红豆杉当年生枝段为外植体诱导的愈伤组织分化出了不定芽，但分化率低，芽体生长速度慢，还远达不到快繁育苗的要求。基于以上情况，以曼地亚红豆杉当年生枝的带芽茎段为外植体进行了腋芽增殖再生植株育苗技术的研究，以期实现曼地亚红豆杉高效快速的繁殖，为药用原料林的培育提供优质壮苗。

1 材料与方法 1.1 植物材料

试验材料为四川农业大学都江堰分校实习苗圃的5年生曼地亚红豆杉扦插苗。

1.2 启动培养

于晴朗午后采健壮母株上的当年生枝条，在洗衣粉溶液中清洗浸泡30 min，35 ℃温水浸泡30 min，剪切成1.5 cm左右的带芽茎段，然后在无菌操作台上用75%的酒精消毒30 s，无菌水清洗3次，0.1%新洁尔灭消毒10 min，无菌水冲洗3次，0.1%的HgCl₂连续2次消毒共12 min，无菌水清洗5次，作为组织培养的外植体接种于表 1所示的正交试验的培养基上。每处理接种30个外植体，重复3次。接种后置全自动光照培养箱进行培养，培养温度(25±1) ℃，光照时间12 h·d^-1，光照强度1 500 lx。培养40 d后统计启动率。启动率(%)=(腋芽己萌发的外植体数/无菌外植体数)×100。

1.3 继代培养

启动培养获得的无菌苗转接到表 2所示的继代培养基上生长，以获得生长健壮的无根苗。同时，以不添加生长调节物质的不同基本培养基(见表 3)进行继代培养，每处理30个外植体，重复3次。培养30 d后统计有效芽率、平均苗高。有效芽率(%)=(苗高＞2.0 cm苗数/接种苗数)×100；平均芽长(cm)=有效苗高总和/有效苗数。

1.4 生根培养 1.4.1 组织培养生根

继代培养得到的生长健壮、苗高2 cm以上的芽接种到生根培养基上。每处理30个外植体，重复3次。接种3个月后统计生根率、根长、根数。

1.4.2 瓶外生根

将继代培养得到的生长健壮、苗高2 cm以上的无根苗从培养瓶中取出，洗净基部培养基，分别用ABT、IBA作生根促进剂，浓度1 000 mg·L^-1、500 mg·L^-1，速浸30 s后插入经高压灭菌后的蛭石上。每处理插30个无根苗，重复3次。扦插后置室内，自然光照，经常喷水保湿。2个月后统计生根率。

2 结果与分析 2.1 曼地亚红豆杉腋芽的启动萌发

曼地亚红豆杉带芽茎段接种后10 d侧芽开始萌动，芽膨大，芽鳞张开，同时茎段切口处开始膨大，产生愈伤组织。

从表 1可以看出，生长调节物质的不同浓度和配比对芽的启动有极显著影响。一般认为细胞分裂素与生长素比值高有利于芽的萌发，但曼地亚红豆杉芽萌发的适宜细胞分裂素浓度很低。6-BA的3个浓度水平对芽启动的影响有极显著差异，0.05 mg·L^-1的启动率为89.55%，极显著地高于其他两水平，细胞分裂素与生长素的适宜比例为1:10，这可能是由于曼地亚红豆杉内源细胞分裂素水平较高。NAA的0.5 mg·L^-1和0.75 mg·L^-1两水平间启动率没有显著差异，都较适合于曼地亚红豆杉的启动培养，应选用0.5 mg·L^-1。9个试验处理中，处理1和处理2之间启动率没有显著差异，但都极显著地高于其他处理。从节约药品、降低成本的角度从发，处理1：6-BA 0.05 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1是比较适宜的芽启动培养的激素配方。

2.2 继代培养 2.2.1 生长调节物质组合对曼地亚红豆杉继代培养的影响

以MS作基本培养基，采用6-BA和NAA不同浓度的多种组合进行继代培养生长调节物质组合的筛选，试验结果见表 2。

由表 2可以看出，激素组合对继代培养嫩梢的伸长有极显著影响。不添加任何激素的处理的培养基有效芽率极显著地高于其他所有添加激素的处理。这说明生长调节物质对曼地亚红豆杉芽的诱导启动有利，但对芽的生长有抑制作用，这与李胜等(2004)的观点一致。在添加激素的处理中，6-BA浓度低的处理有效芽率极显著地高于6-BA浓度高的处理，而NAA各浓度间规律不明显。这说明，细胞分裂素对芽生长的抑制作用明显，浓度稍高，有效芽率明显下降。而生长素对芽伸长的抑制作用不明显。有效芽长在各种处理间差异不大，且规律不明显，这可能是由于芽的伸长生长量受着外植体本身营养状况的影响较大。由此，应选择不添加任何激素的基本培养基作为继代培养基。

2.2.2 不同基本培养基对曼地亚红豆杉继代培养的影响

生长调节物质对曼地亚红豆杉芽的诱导有效，但对芽的生长有抑制作用。选用不添加激素的培养基作为曼地亚红豆杉的继代培养基。由表 3可以看出，不同的基本培养基类型对曼地亚红豆杉芽的伸长生长作用有极显著差异。MS(有机物加倍)的有效芽率和平均芽长都极显著地高于MS(铁盐加倍)、MS、1/2MS WPM和1/2WPM。所以MS(有机物加倍)是曼地亚红豆杉继代培养的适宜培养基。

2.3 生根培养 2.3.1 组织培养生根

将继代培养得到的长于2 cm的无根苗转接到生根培养基上，2个月后长出不定根。生根培养基配方和不定根发生情况如见表 4。

由表 4可以看出，曼地亚红豆杉不定根的诱导比较困难，生根率较低，最高只有27.78%。生根时间长，根系生长较慢。诱导2个月后，最长平均根长仅为1.24 cm。WPM和MS都可作为曼地亚红豆杉生根诱导的基本培养基。WPM生根率更高。但在相同激素组合情况下，MS培养基上不定根发生数量更多，为4.7条，但发根较迟，接种50 d后才开始出现乳白色根突起。从生长调节物质组合来看，单独使用生长素的培养基都没有发生不定根，而配以低浓度细胞分裂素的培养基上都有不定根的发生。这说明曼地亚红豆杉不定根的发生需要在植物体内建立一个最佳的细胞分裂素和生长素的平衡，而不仅仅是需要生长素。尽管细胞分裂素被认为对生根有抑制作用，但在后期这种抑制作用会消失，而根原基的发育似乎依赖于细胞分裂素。WPM+6-BA 0.05 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1是曼地亚红豆杉较适宜的生根培养基。

将己经生根的小苗转移到不含激素的WPM培养基上，根系会伸长生长，并再发生不定根。30 d后，平均根数可达5.5条，平均根长达1.6 cm，最长根长5.2 cm，所得全苗如图 1。这是因为在根的伸长阶段生长素并非必需，而且会抑制根的生长发育。所以，通常在对木本植物进行生根培养时采用两步法：即先在富含生长素的培养基上进行根的发生，尔后转接到无任何生长调节物质的培养基上进行根的伸长生长(李胜等，2004)。

2.3.2 瓶外生根

将继代培养得到的嫩梢用IBA、ABT作生根促进剂速浸处理后插植于灭菌后的蛭石上，插植后2个月开始出现愈伤组织，3个月后调查生根率如表 5。用IBA作生根促进剂效果极显著地优于ABT，且IBA 1 000 mg·L^-1处理生根率最高，达到58.33%, 是进行曼地亚红豆杉组培无根苗生根诱导的适宜处理方式。通过瓶外生根获得的全苗茎基部愈伤组织小，有利于移栽成活。所得全苗如图 2。

3 结论

通过选择腋芽增殖启动培养、继代培养、生根培养各阶段的最优培养基和培养技术，可获得完整的曼地亚红豆杉试管苗。生长调节剂的不同浓度和配比对芽的启动有极显著影响。MS+6-BA 0.05 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1是曼地亚红豆杉腋芽增殖启动培养的适宜培养基。细胞分裂素对芽的诱导有利，但对芽的生长抑制作用明显，浓度稍高，有效芽率便明显下降。生长素对芽伸长的抑制作用不明显。不添加生长调节物质的MS(有机物加倍)培养基是曼地亚红豆杉侧芽继代培养的适宜培养基，有效芽率为72.73%，平均芽长3.3 cm。曼地亚红豆杉不定根的诱导比较困难，生根率较低，最高只有27.78%。生根时间长，根系生长较慢。WPM+6-BA 0.05 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1是曼地亚红豆杉较适宜的生根培养基，生根率27.78%。将己经生根的小苗转移到不含激素的WPM培养基上30 d后，平均根数可达5.5条，平均根长达1.6 cm，最长根长5.2 cm。培养条件为光照时间12 h·d^-1，光照强度1 500 lx，培养温度(25±1) ℃。用IBA 1 000 mg·L^-1作生根促进剂处理30 s进行瓶外生根，生根率达到58.33%，是进行曼地亚红豆杉组培无根苗生根诱导的适宜处理方式。

4 讨论 4.1 植物生长调节物质对曼地亚红豆杉芽启动培养的影响

植物生长调节物质对曼地亚红豆杉芽的启动有极显著影响。6-BA和NAA的浓度和两者之间的比例都要在较低的水平上才能获得较高的启动率。尤其是6-BA的浓度稍微提高都会使启动率下降。这与何碧珠等(2003)需要用较高浓度(4 mg·L^-1)的促进芽分化能力最强的细胞分裂素2 ip来诱导曼地亚红豆杉芽启动的结果刚好相反。这可能是由于外源生长调节物质处理就是为了调节外植体达到一个适宜芽启动的生长素和细胞分裂素水平。而不同品种的外植体材料其内源激素水平可能有较大差异，所以所需的外源生长调节物质也就不同。

4.2 曼地亚红豆杉试管苗的生根培养

在本次试验组培生根和瓶外生根都获得了曼地亚红豆杉组织培养苗的全苗。瓶外生根效果较好，生根率较组培生根高，茎段基部愈伤组织小，有利于移栽成活，且减少了炼苗的过程，避免了污染，降低了成本，是值得继续探索的曼地亚红豆杉组培苗生根方式。但总的来看，生根率还较低，生根时间还较长，这都会阻碍曼地亚红豆杉组织培养育苗的产业化。因此，关于曼地亚红豆杉生根过程中枝条的生理变化、生根机制以及生根的适宜培养基和培养条件还有待于进一步探索和研究，以提高生根率，缩短生根时间，推动曼地亚红豆杉组织培养育苗的产业化。