脂肪酸都有一个长的烃链和一个羧基末端，烃链以线性的为主，不同脂肪酸之间的区别主要在于烃链的长短、饱和与否及双键的数目和位置等。根据烃链的饱和程度，可将脂肪酸分为：1)饱和脂肪酸(SFA)，其烃链是饱和的，无双键；2)单不饱和脂肪酸(MUFA)，含有1个双键；3)多聚不饱和脂肪酸(PUFA)，含有2个以上的双键。饱和脂肪酸在脂肪酸去饱和酶的作用下形成不饱和脂肪酸，包括棕榈油酸和油酸等单不饱和脂肪酸，以及亚油酸和亚麻酸等长链多聚不饱和脂肪酸。植物脂肪酸去饱和作用可在叶绿体和内质网上进行，一部分不饱和脂肪酸可以由位于叶绿体的18:1脂肪酸去饱和酶催化而成，但绝大多数的不饱和脂肪酸由位于内质网上的18:1脂肪酸去饱和酶催化而来(Browse et al., 1991; Mlquel et al., 1992; Rawsthorne, 2002; Thelen et al., 2002)。多聚不饱和脂肪酸都是生物膜的必要组分，许多试验表明不饱和脂肪酸在增加膜的流动性中发挥重要作用(Hugly et al., 1992; Mlquel et al., 1993)，质膜中不饱和脂肪酸含量同生物体抗寒耐盐等抗逆性有直接的相关性(Samala et al., 1998; Suresh et al., 2002; 刘汉梅等，2005; 毛志滨等，2006)。用基因工程手段将脂肪酸不饱和酶基因在烟草(Nicotiana tabacum)中超量表达，结果发现转基因烟草膜脂不饱和脂肪酸显著增加，耐低温能力加强(Kodama et al., 1994)。许多高等植物叶部细胞脂肪酸组分中，18:2和18:3两种多聚不饱和脂肪酸大于70%，在根等一些非光合作用器官中也要占到55%~70%(Harwood，1980)。位于内质网上的油酸去饱和酶FAD2是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶(Okuley et al., 1994)，该脂肪酸去饱和酶的重要功能就是催化产生18:2多元不饱和脂肪酸，在单不饱和脂肪酸中引入第2个双键。本文以毛白杨(Populus tomentosa)为材料，将生物信息学和分子生物学相结合，克隆毛白杨油酸去饱和酶PtFAD2基因，不仅具重要的理论意义，而且还有广泛的应用前景，为杨树等植物的脂肪酸基因工程研究提供基础。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 生物信息学数据库

PopulusDB，AspenDB，PoplarDB为世界上3个大型的杨树EST数据库。美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)提供并维护的BLAST数据库(Blast Databases)，网址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

1.1.2 网络服务器和软件

序列比对工具BLAST(2005)是一个在庞大的数据库中查找同源序列的在线程序。在PopulusDB、AspenDB、PoplarDB 3个杨树EST数据库和美国国家生物技术信息中心BLAST数据库中选用BLASTn、BLASTx、tBLASTn等程序进行核苷酸序列和蛋白质序列的在线比对。在本地计算机上用Primer Premier 5.00、Clustal X、DNAman等生物软件做序列转换和同源性分析。

1.1.3 试验材料及其来源

1) 植物材料    毛白杨形成层取自4年生河北省易县毛白杨。所用植物材料取样后立即液氮速冻，并于液氮中冷冻保存直至使用。2)菌株    大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自北京天为时代科技有限公司。3)化学试剂    Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pGEM-T-easy载体、限制性内切酶购自Promega公司；dNTP、Taq DNA聚合酶购自上海生物工程有限公司；X-Gal、IPTG购自TaKaRa公司；氨苄青霉素(Amp)购自华美生物工程公司；D2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder购自北京天为时代科技有限公司；PCR产物胶回收试剂盒购自北京博大生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。4)寡核苷酸引物    设计的引物由北京博亚生物技术有限公司合成。

1.2 方法 1.2.1 杨树PtFAD2基因cDNA的电子克隆

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)油酸去饱和酶FAD2基因(Genebank注册号：NM-112047)为信息探针，在Dendrome林木基因组数据库的PopulusDB、AspenDB、PoplarDB 3个杨树EST数据库中运行tBLASTn程序。以tBLASTn搜索3个杨树的EST数据库，选择与拟南芥FAD2相似性最高的EST序列，将这条EST序列在杨树的EST数据库和NCBI数据库中运行BLASTn程序，选择比对分值最高的EST序列，找出序列一致的部分，人工拼接合并EST，从而将原EST分别向-3′端和-5′端进行延伸；将延伸的EST序列再次用BLASTn程序在杨树的EST数据库中进行比对，多次延伸最终拼接得到杨树油酸去饱和酶PtFAD2基因cDNA理论序列。

1.2.2 毛白杨RNA提取和cDNA第一链的合成

毛白杨形成层总RNA的提取使用QIGEN公司试剂盒(Qiagen RNeasy Plant Mini Kit)；cDNA第一链的反转录合成使用Clonetech公司试剂盒(BD SMART^TM mRNA Amplification Kit)，操作按照试剂盒的说明。

1.2.3 毛白杨PtFAD2全长cDNA编码序列的分子克隆

根据拼接的序列设计PCR引物PtFAD2 Fr：5′-CACTC CCTTTCTCCCTTATC-3′，PtFAD2 Re：5′-TCAACAAGACAGGG AGGCTA-3′。以毛白杨cDNA一链为模板，用Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：94 ℃ 4 min预变性后，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。扩增得到的目的条带经电泳割胶回收后与pGME-T-easy载体连接，4 ℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据IPTG、X-gal蓝白显色反应筛选阳性克隆，获得重组质粒。重组质粒分别用EcoRⅠ酶切和PCR方法进行验证，证明重组子中含有目的片段，得到重组子pGEM-T-PtFAD2，然后由北京博亚公司完成序列测定，得到毛白杨PtFAD2基因序列。

1.2.4 毛白杨PtFAD2的序列分析

用DNAstar、Primer Premier 5.00、Match code软件对毛白杨PtFAD2基因cDNA编码氨基酸序列进行分析；并在NCBI提供并维护的BLAST数据库中进行序列同源性比对和相似性搜索，多序列比对采用Clustal X软件；用DNAman软件分析同源基因间的进化关系，并构建系统关系聚类图。

1.2.5 毛白杨PtFAD2的组织表达分析

采用RT-PCR半定量法对PtFAD2基因在毛白杨组培苗叶、茎、根中的表达进行分析。毛白杨组培苗约10 cm高，具12片叶，培养基为1/2 MS，附加激素NAA 0.05 mg·L^-1+IBA 0.05 mg·L^-1，生长条件25 ℃，16/8光周期。并且将生长在25 ℃的毛白杨组培苗突然移入到4 ℃进行低温处理，在处理的10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h分别取叶片，分析该基因表达对低温诱导的反应。在表达模式分析的RT-PCR反应中，从毛白杨形成层细胞中提取mRNA反转录的第一链cDNA为模板，扩增PtFAD2用引物PtFAD2 Fr：5′-CACTCCCTTTCTCCCTTATC-3′，PtFAD2 Re：5′-TCA ACAAGACAGGGAGGCTA-3′，以肌动蛋白基因(actin)为扩增内部参照，actin引物为actin Fr：5′-GGGTAGACCAAGACACACTGG-3′，actin Re：5′-GGATGGCATGTGGAAG GGCAT-3′。PCR扩增的条件为：94 ℃ 4 min预变性后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，actin扩增26个循环，PtFAD2扩增31个循环，最后72 ℃延伸7 min。

2 结果与分析 2.1 毛白杨PtFAD2基因cDNA编码序列全长克隆

根据拼接好的序列，两端设计PCR引物，通过RT-PCR的方法得到了毛白杨PtFAD2基因的cDNA克隆(GenBank注册号：DQ316788)。该克隆的cDNA长1 276 bp，PtFAD2重组质粒为pGEM-T-PtFAD2(图 1)。该序列(图 2)包括起始密码子ATG和33 bp的5′末端非编码区(5′UTR)，终止密码子TGA和76 bp的3′末端非编码区(3′UTR)。经过DNAStar软件的序列分析，发现其完整的开放读码框(ORF)共编码388个氨基酸。

2.2 毛白杨PtFAD2基因序列同源性比较及聚类分析

推断克隆基因的编码蛋白氨基酸序列，利用基因数据库资源进行同源性比较是判定基因功能的常用手段。通过同源性分析，可以判断基因编码蛋白的功能。将推测得到的PtFAD2氨基酸序列用NCBI的BLASTX软件进行同源性搜寻，结果显示与其同源的序列全部是脂肪酸去饱和酶FAD2基因，因而有理由相信根据保守性区段克隆到的基因就是杨树脂肪酸去饱和酶基因，按通用命名原则命名为PtFAD2。利用Clustal X软件将推测的杨树PtFAD2氨基酸序列同这些已知基因序列进行多序列同源比较，部分区域可达完全一致(图 3)。在进一步的比对分析后发现，毛白杨与油桐(Vernicia fordii)的油酸去饱和酶基因近缘的相似性高达85%，与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、玻璃苣(Borago officinalis)多种植物的FAD2基因编码的氨基酸序列相似性也都在75%以上。8个序列比较结果如图 3所示，共比较了388个氨基酸残基，高度保守的达到80%以上，其中有200个氨基酸残基完全保守，占51.5%(上标“*"者)，另有77个氨基酸残基高度保守，占19.8%(上标“:”者)，32个氨基酸残基较高度保守，占8.2%(上标“·"者)。

对毛白杨、油桐、拟南芥、甘蓝型油菜、陆地棉、大豆、烟草、玻璃苣几种植物的FAD2基因在氨基酸水平上用DNAman软件做聚类分析(图 4)，发现毛白杨和油桐最先聚合，在进化上显示亲源关系最近，接着与大豆聚合，然后再与陆地棉、烟草聚合；拟南芥与甘蓝型油菜最先聚合，然后再同其他类群聚合到一起；其中玻璃苣在聚类中显示其进化属较远分支。

2.3 PtFAD2基因在不同组织中的表达以及在低温处理中的表达变化分析

采用半定量RT-PCR法，以毛白杨肌动蛋白基因actin为基因表达内部参照，对PtFAD2在根、茎、叶片中的表达以及受低温诱导后的表达情况进行了分析。结果(图 5)表明，PtFAD2基因在根、茎、叶片3种器官中均有表达，并且3种器官中的表达量没有发现明显差别，说明PtFAD2表达没有组织特异性。在经4 ℃低温处理中，处理时间为10 min，30 min，1 h，2 h，6 h，12 h和24 h，PtFAD2叶片中的表达量没有变化，表明在短时间的低温处理过程中该基因不受诱导，这种情况与拟南芥中的AtFAD2低温诱导表达模式类似(Okuley et al., 1994)。

3 讨论

将电子克隆与分子生物学手段相结合主要有以下优点：只需能够上网的计算机和PCR仪等仪器即可进行试验，同源性比较、EST拼接等工作在计算机上完成，只需RT-PCR进行序列验证，试验成本较低，所需设备简单；试验只涉及到RNA提取、mRNA反转录、PCR扩增等分子生物学操作，技术难度不大。本方法在实际应用中应该注意基因来源的物种与被研究的物种亲缘关系不宜太远，基因长度不要太长(< 2 kb)，否则可能会给数据库基因拼接分析和试验操作带来困难。

FAD2是催化产生亚油酸(C 18:2)多元不饱和脂肪酸重要的酶，在树木中关于这个基因的研究非常少，在杨树中还没有研究报道。本试验研究利用现有的杨树基因组EST序列库资源，首先用电子克隆方法通过同源序列搜索拼接合并获得了杨树油酸去饱和酶基因的cDNA理论序列，然后运用RT-PCR等分子生物学手段成功克隆得到了毛白杨PtFAD2基因序列全长编码cDNA，这是有关毛白杨油酸去饱和酶基因PtFAD2研究的首次报道。本研究获得了毛白杨油酸去饱和酶基因PtFAD2，为基因工程手段调控杨树等植物中不饱和脂肪酸的合成提供了基础；虽然短时间内PtFAD2的表达不受低温的诱导，但是本研究为调节脂肪酸去饱和酶基因的转录水平和酶活性提供了可能。由于多元不饱和脂肪酸与植物抗逆性之间的紧密联系(Routaboul et al., 2000; Murakami et al., 2000; Martzi et al., 2006)，因此本研究为培育杨树等植物抗逆基因工程研究提供了基础。