光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)是我国重要的多食性蛀干害虫，已造成重大的经济损失(黄竞芳等，1991；1992；阎凤鸣，2002)。在光肩星天牛寻找寄主植物的识别过程中，由寄主植物释放的挥发性信息化学物质起着重要的通讯引导作用(景谦平等，2001)。利用这些天然的挥发性化学物质来防治光肩星天牛具有很重要的理论和实践意义。但是如何获得这些天然的活性物质，怎样才能得到好的生物测定结果，一直是困扰研究工作者的一个难题。

超临界流体萃取技术是近20年来发展起来的新型化工技术，因其萃取能力强，无污染，操作温度低等诸多优点而被广泛应用于食品、中草药提取等领域。挥发物成分因其分子量较小和沸点低，因而采用超临界CO₂萃取技术易得到(景谦平等，2001；Hawthome et al., 1988; Henning et al., 1992)；此外，用超临界CO₂萃取技术萃取出的挥发性物质可以直接用于昆虫嗅觉测定，这就为从寄主植物挥发物中筛选对光肩星天牛有引诱活性的化学组分，并对其进行定性定量分析提供了一条新途径。

1 材料与方法 1.1 五角枫(Acer mono)挥发性物质的超临界CO₂萃取

以生长在北京林业大学校园苗圃内的多年生五角枫为试验材料，将1~2年生枝条剪成1 cm左右小段后置于0.3 L萃取釜中进行萃取。

萃取条件：萃取压力设15、20、25 MPa 3个水平；萃取温度设35、40、45 ℃3个水平。采用CL-2型超临界流体萃取机(北京合世科贸有限责任公司生产)进行萃取。超临界萃取的具体流程为：五角枫枝条→剪断后称质量→装萃取釜→超临界萃取设备各部分控制合适的温度、压力、时间→在超临界状态下萃取由脱脂棉吸附→动态收集到吸附管中→TCT-GC/MS分析。

为便于进行光肩星天牛的嗅觉测定试验，该流程中采用脱脂棉作为载体以吸附萃取获得的挥发物。并将吸附有挥发物的载体仔细、快速地称质量，分为0.8、1.2和1.6 mg 3个水平进行生物测定。以等量的未经任何处理的脱脂棉作为对照。

1.2 五角枫挥发物的动态顶空采集及其TCT-GC-MS分析

采用动态顶空法采集脱脂棉中的挥发物，用TCT-GC-MS (Trace 2000 Voyager, Finnigan, Thermo Quest)对挥发物进行定性和定量分析(Jin et al., 2004)。通过Xcalibur1.2版本应用软件检索NIST 98谱图库兼顾保留时间来鉴定物质。挥发物定量采用峰面积归一化法表示各成分的相对百分含量。

1.3 五角枫超临界CO₂萃取物嗅觉行为生物测定

嗅觉行为测定采用Y型嗅觉仪，试验方法参照文献(李继泉，2003)。试验时，挑选活力较强并且触角完好的雌性光肩星天牛作为供试昆虫。每次试验从放虫口放入1头光肩星天牛后开始计时，每次观察20 min，重复10次。

分别称取0.8、1.2、1.6 mg吸附有萃取物的脱脂棉放在样品口；同等质量的未经任何处理的脱脂棉放在对照臂口。每个萃取条件下重复3次。

2 结果与分析 2.1 五角枫超临界CO₂萃取物的GC-MS分析

在所设置的8种萃取条件下，五角枫超临界CO₂萃取物的GC-MS鉴定结果如图 1所示。五角枫超临界CO₂萃取物是由许多挥发性物质组成的。在所有萃取条件下均检测出的化合物有：正己烷、辛烷、3-己烯醛、庚醛、Z-2-戊烯-1-醇、3-己烯醇、乙基己醇、1-甲基环庚醇、2-癸烯-1-醇、丁酸-2-己烯酯、乙酸乙酯、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、2-癸酮、环己基异硫氰酸酯等。在不同压力、温度条件下，萃取得到的挥发性物质的种类和含量也有所差异。例如，在15 MPa-45℃萃取条件下，所得的48种超临界CO₂萃取物中醛类物质含量最高，其中3-己烯醛的相对含量最高，达34.15%；醇类含量次之，其中3-己烯醇相对含量最高，为13.11%。在15 MPa-40 ℃条件下萃取所得的51种挥发物中，醇类物质含量最高，其次为醛类化合物，其中3-己烯醇相对含量最高，为35.93%。在15 MPa-35 ℃条件下萃取所得的36种挥发物中烷烃类含量最高，其次是醇类化合物。在20 MPa-45 ℃条件下萃取所得的50种挥发物中，醇类含量最高，其次为酯类化合物，其中醇类化合物中以2-壬烯-1-醇为主，酯类中以乙酸乙酯为主。在20 MPa-40 ℃条件下萃取所得的41种挥发物中以醇类为主，其次为醛类化合物，其中分别以3-己烯醇和壬醛为主。在20 MPa-35 ℃条件下萃取所得的40种挥发物中以醇类化合物含量最高，为82.95%，其中3-己烯醇含量高，为74.12%。在25 MPa-35 ℃条件下萃取所得的50种挥发物中以醇类为主，其次为醛类，醇类中以3-己烯醇含量最高。在25 MPa-40 ℃条件下萃取所得的30种挥发物中以醇类和烷烃类为主(表 1)。

结果还表明：有些化合物仅在一定的条件下才能萃取出来，如2-甲基-2-丙烯醛仅在25 MPa-30 ℃条件下才能检测出来。3-甲基戊醛仅在25 MPa-30 ℃和20 MPa-40 ℃条件下才能检测出来。1-戊烯-3-醇仅在15 MPa-45 ℃条件下检测到。由此可知，不同萃取条件下所萃取出的挥发性物质有所不同，而且相同组分的相对含量也有差异。如在20 MPa-35 ℃萃取条件下萃取得到的3-己烯醇的相对含量最大，为74.12%，而在20MPa-45 ℃条件下获得的3-己烯醇的相对含量最小，仅为9.57%。

2.2 五角枫超临界CO₂萃取物的嗅觉行为测定结果

光肩星天牛对不同萃取条件下的五角枫超临界CO₂萃取物的行为反应测定结果如表 2所示。以下萃取条件下的挥发物引诱作用显著：0.8 mg载体时，萃取条件为15 MPa-35 ℃；1.2 mg时的20 MPa-40 ℃；1.2 mg时的25 MPa-35 ℃；1.6 mg时的25 MPa-35 ℃和1.2 mg时的20 MPa-45 ℃的挥发物。其他条件下的均不明显。

3 结论和讨论 3.1 最佳萃取条件的确定

超临界CO₂萃取技术是一种新型的植物活性成分的提取、分离技术，它能在常温下进行萃取分离，可以有效地进行植物挥发性物质的提取。笔者曾在自然状态下利用动态顶空法采集了五角枫的挥发物并进行了TCT-GC-MS分析，将其与超临界CO₂萃取获得的挥发物结果进行比较，结果表明：超临界CO₂获得的挥发物在植物自然状态下均可检测到，只是超临界CO ₂获得的挥发物种类较少，所以笔者认为超临界CO₂萃取获得的挥发物可用于光肩星天牛的行为测定。

传统的超临界CO₂萃取技术在进行最佳萃取条件的选择时，通常依据的是目标产物的萃取率。笔者曾利用超临界CO₂萃取技术萃取复叶槭植株中的挥发物，发现在10、15、20 MPa条件下，随着萃取压力的增加，萃取的种类和含量也增加；在35~55 ℃范围内，随着萃取温度的增加，萃取物的种类和含量反而减小，萃取时间在15~60 min范围内，不同挥发物的萃取效率出现最大值的时间不同。

在本试验中笔者不是以目标产物的最大萃取率作为最佳条件的选择，而是以对光肩星天牛具有显著引诱作用时的萃取条件作为最佳的萃取条件。测定结果可知，在15 MPa-35℃、25 MPa-40℃、25 MPa-35℃、20 MPa-45℃ 4种萃取条件下，五角枫超临界CO₂萃取物对光肩星天牛均有引诱作用，且达到了显著的程度，可初步确定4种萃取条件为研究调控光肩星天牛趋性行为的挥发性化合物较佳萃取条件。同时发现：同一萃取条件下获得的萃取物，由于试验时所用挥发物载体的质量不同(也就是说用于嗅觉测定的挥发物的总量不同)，导致光肩星天牛的行为反应出现差异。在对上述4个萃取条件下的结果做综合分析后发现，相对而言，25 MPa-35℃条件下1.2和1.6 mg的萃取物载体对光肩星天牛的引诱作用最为显著，因此，在本研究所设计的参数范围内，将该萃取条件作为最佳萃取条件。本研究还表明：用超临界CO₂萃取技术萃取寄主植物的挥发性化合物用于昆虫的生物测定，该方法是可行的，有助于从众多的挥发物组分中筛选出对光肩星天牛有引诱作用的混合组分，从而为光肩星天牛寄主选择定位所需化学信号的指纹图谱研究又提供了一种可行的方法。当然，由于所设条件有限，本研究所确定的最佳条件还有待于进一步的优化。

3.2 五角枫挥发性信息化学物质的综合分析

五角枫超临界CO₂萃取物是由多种微量的挥发性化学物质组合而成的混合物。生物测定的是针对该组混合物对光肩星天牛的影响。由GC-MS分析测试结果可知，不同萃取条件下，五角枫超临界CO₂萃取物的化合物成分不同；相同成分在不同萃取条件下所占的比例也不同。也正是由于挥发物种类和相对比例的不同，致使光肩星天牛具有不同的行为反应。实验数据表明：25 MPa-35℃萃取条件下的五角枫超临界CO₂萃取物对光肩星天牛具有显著的引诱作用。其化合物组成主要有二氯甲烷、三甲基戊烷、正己烷、氯仿、二氯乙烷、3-己烯醛、庚醛、3-己烯醇、1-己醇、2-乙基己醇、丁酸-2-己烯酯、乙酸乙酯、α-蒎烯、2-癸酮、2, 3-丁二酮、癸醛、壬醛、乙酸-3-己烯酯、(E)-2-己烯醛、(Z)-2-癸烯醛、1-戊烯-3-醇、(Z)-乙酸己酯、石竹烯。其中3-己烯醇在该混合物中所占的比例最高，达38.75%，其次为乙酸-3-己烯酯，其相对含量为10.41%。李继泉(2003)的试验表明：不同浓度的3-己烯醇、2-乙基己醇和乙酸乙酯对光肩星天牛具有一定的引诱作用，不同浓度的癸醛、壬醛、乙酸-3-己烯酯和(E)-2-己烯醛对光肩星天牛的引诱作用均达到了显著的水平。可能正是这些物质的作用致使25 MPa 35℃超临界萃取条件下的挥发物对光肩星天牛具有显著的引诱作用，因而笔者推测癸醛、壬醛、3-己烯醇、乙酸-3-己烯酯等物质很有可能是光肩星天牛寄主选择定位指纹图谱的重要组成部分。目前，还有许多化合物对光肩星天牛的作用浓度和引诱效果不很清楚，故很难得出对光肩星天牛具有引诱作用的指纹图谱，还需进行深入的研究。此外，有些化合物在单独测定时可能不发挥作用，而与其他化学物质混配时则起到增效或协同作用。因此，在寻找光肩星天牛的寄主植物挥发性信息化合物时应综合考虑这些因素。光肩星天牛作为杂食性昆虫，其寄主选择定位的化学信息物质不可能唯一，这也正是研究其引诱剂的困难之处。

植物挥发物间的相对含量在调控昆虫行为中发挥着重要作用，如苗振旺等(2002)的实验发现不同配比引诱剂对红脂大小蠹(Dendroctonus valens)的引诱效果是不同的。由于阔叶植物挥发性化学物质种类较多、而挥发量较低，定量较困难，所以在研究植食性昆虫利用植物挥发性信息化合物识别寄主植物时，关于挥发物之间比例的研究就更难更少了(Visser, 1986)。

在研究植物挥发性物质对植食性昆虫行为的影响时，许多研究采用鉴定出的纯化合物单体、溶剂粗提液(Koschier et al., 2000；Hammack, 2001; Leskey et al., 2000；2001; Fan et al., 2003)或吸附剂吸附后的溶剂洗脱液来用于生物测定(阎凤鸣等, 2002; Jang et al., 1997)，继而寻找、确定控制昆虫行为的挥发性信息化学物质。但这些方法存在费时、溶剂有选择性影响等缺点。而用植物的超临界CO₂萃取物直接进行昆虫生物测定，消除了溶剂的影响，减少了中间过程，提高了结果的可靠性。笔者在试验中利用超临界CO₂萃取的混合物直接进行光肩星天牛的行为反应，该方法的应用对进一步探明光肩星天牛寄主选择定位化学信息的指纹图谱，具有一定的实践意义，有必要进行深入研究。