外生菌根真菌不仅能促进宿主生长，提高宿主抗逆能力，而且能增强宿主抗病的能力。Davis等(1942)发现外生菌根可以减轻植物根部病害。Stact等(1975)认为：在病原镰刀菌(Fusarium sp.)感染的苗圃土壤中，加入外生菌根菌漆蜡蘑(Laccaria laccata)的担孢子，能大大降低北美黄杉(Pseudotsuga menziesii)幼苗的死亡率。孟繁荣等(1991)用外生菌根菌纯培养物对落叶松(Larix spp.)、樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)幼苗进行人工接种，降低了松苗猝倒病的发病率。在研究外生菌根菌对杨树溃疡病的影响时发现：菌根苗溃疡病的发病率和病情指数均低于对照，菌根菌增强了杨树对溃疡病的抗性(陈辉等，1996；唐明等，1994)。

在外生菌根增强宿主抗病性方面，国内外的研究大多集中在根部病害上(雷增普等，1989)，对菌根与非根部病害的关系研究很少。Kikuchi等(1991)研究外生菌根真菌对松树抗松材线虫病的影响，发现外生菌根真菌Suillus luteus和Rhizopogon rubescens能轻微地增强日本赤松(P. densiflora)对松材线虫的抗性，死亡率下降。在国内关于外生菌根与松材线虫病的关系尚未有人研究。本试验尝试对几种松树外生菌根与松枯梢病及松材线虫病的关系进行研究，通过对菌根苗的抗性测定，探讨外生菌根是否能增强寄主对非根部病害的抗性，从而为病害的生物防治及增进森林健康提供参考。

1 材料与方法 1.1 供试病原物及来源

松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)：南京林业大学森林病理实验室保存的强毒菌株J₂，分离自江苏连云港海岸松(P. pinaster)。

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)：来自安徽和县马尾松(P. massoniana)病株的强毒虫株19#。

1.2 供试外生菌根菌与松苗

本试验供试的外生菌根真菌分别为：黄豹斑鹅膏(Amanita pantherina, EG)、美味牛肝菌(Boletus speciosus, 505)、华美牛肝菌(B. edulis, 504)、紫金蜡蘑(Laccaria aemthystea, ZJ)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)2菌株Pt₁和Pt₂、黄色须腹菌(Rhizipogen luteous, HX)。

接种松枯梢病菌的松苗：马尾松和湿地松(P.elliottii)接种504、505、Pt₁、Pt₂、EG、HX和ZJ 7种外生菌根菌形成的菌根苗及无菌根的对照苗，7月生。

接种松材线虫的松苗：黑松(P. thunbergii)和马尾松接种504、505、Pt₁、Pt₂、EG 5种外生菌根菌形成的菌根苗及无菌根的对照苗，6月生。

1.3 试验方法 1.3.1 病原物的培养

松枯梢病原菌的培养：挑取少量的松枯梢病原菌菌丝到PSA平板上，25 ℃温箱中恒温培养4 d后使用。

松材线虫的培养：采用贝尔曼漏斗法分离纯培养的线虫，用无菌水洗涤3次后，接到三角瓶中长满盘多毛孢菌的玉米粒上，25 ℃恒温培养扩繁，待线虫长满后转移至冰箱中保存。接种前再经分离、无菌水洗涤3次后使用。

1.3.2 菌根苗生长指标测定

马尾松、黑松和湿地松苗分别接种7种外生菌根真菌后6个月，测定其苗高和地径。

1.3.3 菌根苗对松枯梢病的抗性测定

采用有伤接种法。用消毒剪在菌根苗梢中部去除一针叶, 然后在培养好的松枯梢病菌平板菌落边缘，取一直径约3 mm的菌丝圆片，接种至松苗伤口上，套袋保湿48 h，每处理9个重复。对照为无菌根苗，处理相同。

测定方法：根据小苗发病情况, 设立分级标准, 定期检查发病率和病情指数。

分级标准：0：健康；Ⅰ：梢上少数针叶褐变萎蔫或梢茎部稍有萎缩；Ⅱ：梢一半以上针叶褐变萎蔫或梢茎部一半以上萎缩；Ⅲ：梢全萎, 但仍有绿叶；Ⅳ：整株枯萎。

1.3.4 菌根苗对松材线虫病的抗性测定

采用人工皮接法。用消毒解剖刀在松苗茎干中偏下部削去一小块树皮，用封口膜围绕伤口包裹成漏斗状，然后塞入一大小合适的棉球，用微量进样器注入线虫悬浮液，接种量为每株1 200条·(50μL)^-1，每处理7个重复。对照为无菌根的苗，接种处理相同。

测定方法：根据松苗发病情况，定期检查发病率，并设立分级标准，计算病情指数。

分级标准：0：健康；Ⅰ：少数针叶褪绿或萎缩；Ⅱ：半数针叶褪绿或萎缩，失去光泽；Ⅲ：大部分针叶褪绿或萎缩下垂；Ⅳ：所有针叶全部褪绿或萎缩，全株枯萎。

1.3.5 黑松菌根苗接种松材线虫后体内PAL活性测定

接种后分别于一定时段采集适量新鲜样品，-4 ℃以下冷冻过夜，剪碎，加缓冲液冰浴研磨，匀浆，离心，上清液为酶提取液。参照樊自红等(1989)的方法在紫外可见分光光度计上测定，以每小时每毫克蛋白的O.D.值变化0.01为一个酶活力单位(U)。

2 结果与分析 2.1 外生菌根菌对3种松苗生长的影响

马尾松、黑松和湿地松苗木接种7种外生菌根菌后6个月，马尾松菌根苗的苗高和地径与对照相比增幅最大，其平均增长率分别为20.91%和32.67%；其次为黑松；而湿地松菌根苗增长最少(表 1)。在供试的7种菌根菌中，以504和EG的促生效果最好。

2.2 外生菌根对松苗抗松枯梢病的影响 2.2.1 外生菌根对马尾松抗松枯梢病的影响

马尾松菌根苗和对照接种松枯梢病菌3 d后，各处理开始表现症状，其中对照感病最重，发病率达100%，接种10 d后对照几乎已全部萎蔫死亡；此时504菌根苗感病最轻，发病率为44.4%，病情指数仅为13.9(图 1-a)；EG(图 1-b)和Pt₂病情发展缓慢，病情指数也较低，表现出一定的耐受力；Pt₁和ZJ病情发展迅速，病情指数已分别达61.1和77.8，感病较重，但比对照发病程度稍轻；HX菌根苗的病情指数为50，发病率为66.7%，仍未全部发病；505菌根苗已全部发病，但病情指数不高(图 2)。

2.2.2 外生菌根对湿地松抗松枯梢病的影响

湿地松菌根苗和对照接种松枯梢病菌后，各处理均发病严重(表 2)。接种3 d，对照的发病率和病情指数已分别达88.8%和33.3；此时EG菌根苗发病率和病情指数相对最低，分别为33.3%和5.5；其他6种菌根苗发病率都在60%以上，且病情指数大多在20以上，虽低于对照，但相差不大。接种10 d后，各处理的病情加剧，其中504(图 3)、Pt₂、HX菌根苗的发病严重度与对照相同，对照的发病率和病情指数已达100%和75。EG菌根苗虽然刚发病时病情较轻，但此时发病率已达100%，病情指数已达66.7，病情发展迅速。其他菌根苗虽然发病率和病情指数比对照低，但差距都不大。由此可见，7种菌根苗虽在接种早期对延缓病情似有一定作用，但均未表现出明显的抗性。

2.3 外生菌根对松苗抗松材线虫病的影响 2.3.1 外生菌根对黑松抗松材线虫病的影响

黑松菌根苗接种松材线虫后，其发病情况如表 3所示。接种7 d，黑松苗开始发病，对照发病率达100%，病情指数达64.3；此时Pt₂菌根苗的发病率为14.3%，病情指数仅为3.6，远远低于对照；其次为EG菌根苗，发病率和病情指数分别为57.1%和21.4；504、505和Pt₁菌根苗的发病率都低于对照，病情指数也较低。

接种16 d后，对照全部死亡，而Pt₂和EG菌根苗的病情指数仅为42.9，对松材线虫的抵抗力较强(图 4)；其次为504菌根苗，发病率和病情指数分别为85.7%和60.7；505和Pt₁菌根苗的病情指数相对较高，但仍低于对照(图 4)。总之，黑松菌根苗的病情指数都低于对照，菌根的形成使黑松对松材线虫病抵抗力增强，延缓或减轻了黑松的死亡。

2.3.2 黑松菌根苗接种松材线虫后早期体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)的变化

黑松菌根苗接种松材线虫后各处理体内的PAL活性存在一定差异(图 5)：接种后12 h，Pt₂菌根苗的PAL活性最高，其次为504菌根苗，均明显高于对照。接种24 h后各处理的PAL达一高峰，活性均高于CK。随后PAL活性迅速下降，至36 h时达一较低值，此时仅505菌根苗的PAL活性低于CK。此后各处理PAL活性再次升高，于48 h达次高峰，其中Pt₂菌根苗的PAL活性仍最高，这与后期其菌根苗病情指数较低相一致。而505菌根苗的PAL活性在30~70 h时处在低于CK的水平，72 h后略高于CK；这也与其后期病情指数较高相吻合。接种72 h后，CK的PA L活性最低，其苗木病情指数最高。这表明菌根苗体内PAL酶活变化与其抗病性有一定关系。

2.3.3 外生菌根对马尾松抗松材线虫病的影响

马尾松菌根苗接种松材线虫后，发病情况见表 4。马尾松也在7 d开始发病，但发病较轻，此时对照苗的发病率和病情指数与505、Pt₁菌根苗相同，分别为14.3%和10.7；504菌根苗的发病率也和对照相同，但病情指数稍低，为3.6；Pt₂和EG菌根苗还未发病。

接种16 d后，对照发病加重，发病率和病情指数分别为85.7%和60.7；Pt₁的发病率和对照相同，但病情指数高于对照，发病较重，对松材线虫的抵抗力未得到提高；此时504和Pt₂菌根苗仅轻微感病，发病率和病情指数分别为14.3%和7.1；EG菌根苗发病也较轻，发病率和病情指数分别为42.9%和28.6(图 6)；505菌根苗的发病率超过对照，达100%，病情指数也较高，未表现抗性。

3 结论与讨论

外生菌根增强了马尾松对松枯梢病的抵抗力，各处理的菌根苗都比对照苗发病轻。其中504菌根苗的抗性最强，其次为EG和Pt₂菌根苗，Pt₁和ZJ菌根苗抗性相对较差。松枯梢病是寄主主导性病害，病害的发生状况与寄主的生长势有很大关系。马尾松的菌根化状况较好，菌根的形成增强了水分和养分的吸收，使其生长状况得到明显改善，因而对松枯梢病的抵抗能力也增强。菌根对松树生长的促进作用越明显，对松枯梢病的抗性就越强。接种504的马尾松菌根苗其苗高和地径的平均增长幅度最大，则对松枯梢的抗性也最强；而Pt₁和ZJ的促生作用相对较小，对松枯梢的抗性也相对较弱。

外生菌根对湿地松抗松枯梢病能力的提高不明显。接种10 d后，各处理的菌根苗和对照苗都严重发病。其原因可能为：1)湿地松菌根化状况普遍较差，且多数菌根菌对湿地松的生长几乎未起到促进作用或提高幅度不大。2)湿地松本身极易感染松枯梢病，对江苏不同松树的新梢组织结构观察表明：无论在易感期还是非易感期，发病较轻的马尾松和黑松的木质化程度均明显高于发病较重的湿地松。对抗病型(马尾松等)和高感型(湿地松等)嫩周皮组织结构的研究似乎也显示：抗病类型周皮组织的细胞层数和组织厚度均有高于感病类型的趋势(万贤崇等，1996；吴小芹，1999)。这些与湿地松的生物学特性有一定关系。因此，仅靠菌根提供的帮助可能无法抵抗病害的发生。3)某些菌根可能仅仅在外部形态上促进了湿地松苗的生长，如苗高、地径等，但却并未对松苗体内抗病结构或抗病物质的生成起到促进作用，如茎的木质化程度、抗性酶的合成等。

对黑松和马尾松菌根苗进行松材线虫接种后发现：菌根增强了黑松和马尾松对松材线虫病的抵抗力，延缓或减轻了松苗的死亡。接种16 d后，黑松对照苗全部死亡，但黑松菌根苗的病程发展缓慢，表现出一定的耐受力。马尾松对松材线虫病的抵抗力强于黑松，在相同的时间里，马尾松各处理的发病率和病情指数几乎都比黑松低。接种松材线虫16 d时，马尾松504和Pt₂菌根苗表现出较强的抗性，EG菌根苗发病也较轻，但505和Pt₁菌根苗发病较重，对松材线虫的抵抗力未得到提高。

黑松菌根苗接种松材线虫后各处理体内的PAL活性存在一定差异。不同的菌根苗对松材线虫侵染的反应不同，即对松材线虫抗性较强的菌根苗其体内PAL酶活也较强，反之亦然。说明在接种早期PAL酶活与优良菌根化寄主的抗病性具一定相关性，PAL活性升高加快了苯丙烷代谢的速度，积累了某些对病原物有毒害的次生代谢产物以抵御侵染(海蒂弗斯等，1991)。

松材线虫病通常被认为是病原主导性病害，病害的发生与寄主的生长势关系不大。但从本试验的结果来看，黑松和马尾松接种Pt₂、EG和504后，形成的菌根苗在生长上与对照相比有较大提高，在接种松材线虫后也表现出较强的抗性；而Pt₁和505形成的菌根对松苗生长的促进作用相对较差，其菌根苗对松材线虫病的抗性也相对弱一些。当然，这可能与相对体积的接种密度有关。

过去人们对菌根增强宿主抗病性的研究多集中在根部病害上，而对非根部病害研究很少。本研究发现一些有明显促生作用的优良外生菌根菌可在一定程度上增强松苗抗枯梢病和松材线虫病的能力。研究暗示：供试外生菌根菌的促生作用以及菌根苗体内抗病代谢酶活性的变化与其抗病性有一定的相关性。在抗性机理方面还有待进一步研究。