高山红景天(Rhodiola sachalinensis)是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)的多年生草本植物，具有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗辐射等功能，在运动医学、军事医学、航天医学等领域备受重视(张秀，1993)。但高山红景天生境特殊，分布范围十分狭窄，贮量少，自然萌发率低，加之近年来一些地区大量收购，致使其资源遭到严重破坏，蕴藏量急剧下降，种群处于严重濒危状态，因此，保护高山红景天野生资源对其可持续发展利用具有重要意义(祖元刚等，1998a；1998b)，而原生境保存与离体保存相结合是解决高山红景天种质资源保护问题的重要途径。高山红景天的原生境保护需要在高海拔地区建立种植基地，管理维持不易，因而离体保存显得尤为重要。超低温保存是能保持植物遗传稳定性和用于细胞系、分生组织和愈伤组织材料长期保存的一种好方法(Sakai et al., 1990; Matsumoto et al., 2001; Martinez, 1998)。目前，国内关于药用植物的超低温保存研究十分缺乏，本研究在成功建立高山红景天组织培养体系的基础上，以高山红景天叶片诱导产生的愈伤组织为材料，研究其超低温保存的适宜条件，并对保存后的愈伤组织进行诱导使形成新的植株，为其超低温保存体系的建立提供技术平台。

1 材料和方法 1.1 材料

2004年2月将吉林省长白山地区、黑龙江大海林林场野生的高山红景天小苗移栽于吉林师范大学生命科学学院标本园中，2004年4月取幼嫩叶片为供试材料。

1.2 方法 1.2.1 愈伤组织诱导

取高山红景天成熟叶片，在流水下冲洗1 h，用70%的酒精浸泡30 s，0.1%的升汞溶液浸泡8~10 min，无菌水冲洗5次。在无菌工作台上接入愈伤组织诱导培养基，然后转入光照培养箱进行培养，昼温22 ℃，夜温18 ℃，光照强度800 lx。诱导产生的愈伤组织每个月继代培养1次。

1.2.2 愈伤组织的超低温保存

降温预处理：继代培养不同次数(2~10次)的愈伤组织切成2~3 mm，放入5 mL液氮冷冻管中，加入不同的冰冻保护剂〔10%二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)+ 0.5 mol·L^-1山梨醇(sorbitol)；10%DMSO+0.5 mol·L^-1葡萄糖(glucose)；10%DMSO〕后，置4 ℃冰箱中停留8 h。用Paris750008型程序降温仪以1 ℃ ·min^-1的冷却速度降至-40 ℃，并在此温度条件下停留2 h。超低温保存：将装载愈伤组织及冰冻保护剂并经降温预处理的冻存管取出迅速投入液氮罐中保存72 h。化冻：取出冷冻管在4 ℃冰箱中化冻，或用自来水(18 ℃)冲洗、或浸入不同温度的水浴(30，40，50 ℃)进行化冻。冷冻材料的洗涤：用无琼脂的液体培养基MS+6-BA 2 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1对保存的愈伤组织进行反复冲洗以去除冰冻保存剂。

细胞存活率检测：氯化三苯四氮唑(TTC)法检测细胞存活率(Steponkus et al., 1967)，细胞存活率(%)＝处理后细胞的TTC值×100%/未处理细胞。

冷冻材料的再培养：经化冻洗涤后的愈伤组织转移至MS+6-BA 2 mg·L^-1+ NAA 0.5 mg·L^-1培养基上进行2周的光照或暗培养，2周后进行光照(1 500 lx)培养，培养的温度均为18~22 ℃。观察愈伤组织6周后的恢复生长情况，并统计存活率，存活率(%)=再生出叶片的芽数/总芽数×100%。

冷冻材料的植株再生：将存活的愈伤组织每月继代1次，继代2次后转入MS+6-BA 1 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1进行芽增殖培养。将增殖培养所得的2 cm以上的健壮苗剪下，转入1/2MS生根培养基中，进行生根培养以获得完整植株。

2 结果与分析 2.1 冰冻保护剂种类与继代次数对高山红景天愈伤组织存活率的影响

以继代4次的高山红景天愈伤组织为材料，采用TTC法比较了不同的冰冻保护剂种类对超低温保存后愈伤组织存活率的影响，结果如表 1所示。由表 1可见，不同的冰冻保护剂种类对2种来源的高山红景天愈伤组织超低温保存后的存活率影响大致相同。在3种冰冻保护剂中，均以10%DMSO+0.5 mol·L^-1山梨醇处理的存活率最高，可达80.21%，以10%DMSO处理的存活率最低，仅为42.61%，且10%DMSO+0.5 mol·L^-1山梨醇处理的材料经超低温保存后其存活率显著高于10%DMSO处理(P < 0.05)。综上，10%DMSO+0.5 mol·L^-1山梨醇用作冰冻保护剂对于提高高山红景天超低温保存后细胞的存活率是较为适宜的。

2.2 不同继代次数对高山红景天愈伤组织存活率的影响

以10%DSMO+0.5 mol·L^-1山梨醇作冰冻保护剂，对继代培养2、4、6、8和10次，每次继代后生长2周的高山红景天愈伤组织超低温保存的效果进行了比较，获得的结果如图 1所示。由图 1可以看出，继代次数对2种来源的高山红景天愈伤组织存活率的影响情况大致相同，即：在一定的次数内，随着继代次数的增加，2种来源的高山红景天愈伤组织经超低温保存后的存活率迅速上升，在继代次数达到6次以后，经超低温保存后的愈伤组织存活率则开始呈下降趋势。差异显著性分析表明，2种来源的高山红景天愈伤组织在经4次、6次和8次继代培养并经过超低温保存后其细胞存活率均极显著高于2次继代与10次继代的处理(P < 0.01)。因此，高山红景天的愈伤组织经过6次继代培养时进行超低温保存效果较好。

2.3 化冻方式对高山红景天愈伤组织存活率的影响

以继代4次2种来源的高山红景天愈伤组织为材料，以10%DMSO+0.5 mol·L^-1山梨醇为冰冻保护剂，将超低温保存后的材料在4 ℃冰箱中，或用自来水及不同温度水浴进行化冻处理，研究化冻方式与高山红景天愈伤组织存活率间的关系，所得结果如表 2所示。由表 2可见，不同的化冻方式对2种来源的高山红景天愈伤组织存活率的影响大致相同，不同处理的愈伤组织存活率大小依次为：40 ℃水浴 > 自来水冲洗(18 ℃) > 50 ℃水浴 > 30 ℃水浴 > 4 ℃冰箱内化冻。因此，采用40 ℃水浴和自来水(18 ℃)冲洗是超低温保存后的高山红景天愈伤组织较好的化冻方式。

2.4 光照对超低温保存后愈伤组织恢复生长的影响

将化冻洗涤后的来自长白山与大海林林场的愈伤组织转至培养基MS+6-BA 2 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1上，在22 ℃条件下，分别进行光照(2 000 lx)和黑暗培养。结果表明：光照与黑暗培养的愈伤组织生长差异十分明显。暗培养的愈伤组织恢复生长和再生长的速度均较快，2种愈伤组织存活率分别高达81.09%和77.65%；而光照培养的愈伤组织恢复生长的速度慢，存活率极低，分别为12.07%与9.65%。因此，在进行超低温保存时，黑暗有利于冻存愈伤组织的恢复，而光照对愈伤组织的恢复生长十分不利。

2.5 超低温保存后的高山红景天愈伤组织诱导再生成苗

为检验整个超低温保存方法的实用性，以来自长白山的愈伤组织为材料(图 2-1)，整合愈伤组织存活率最高的条件进行了完整超低温保存程序的研究，该保存程序如下：继代4次的高山红景天愈伤组织放入10%DMSO+0.5 mol·L^-1山梨醇的冰冻保护剂中，在4 ℃冰箱中放置8 h，然后以1 ℃·min^-1的降温速度降至-40 ℃，停留2 h后投入液氮保存，40 ℃水浴中化冻。结果表明，化冻后经TTC法检测其存活率为82.21%，将愈伤组织转入MS+6-BA 2 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1进行暗培养，5周后观察到高山红景天愈伤组织呈鲜绿色，长势较为旺盛，存活率可达到75.64%。将存活的愈伤组织进行继代增殖，继代2次后转入MS+6-BA 1 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1进行芽增殖培养，可获得大量叶芽(图 2-2)。将增殖培养所得的2 cm以上的健壮芽剪下，转入1/2MS生根培养基中，1个月内即可100%生根(图 2-3)。待苗高达4 cm以上时可进行移栽。移栽前将生根苗的三角瓶盖打开，于实验室温度、散射光下炼苗3~4 d；用镊子取出小苗后，洗去根部培养基，移栽于疏松腐殖质壤土中，并加盖透光塑料杯，1周后去杯，成活率达95%以上(图 2-4)。

3 讨论

超低温保存是目前唯一可行的、不需继代就能实现植物种质资源长期保存的理想方法。迄今，许多园艺植物的超低温保存都已见报道(WANG et al., 1994; An et al., 2003; Danso et al., 2004; Rao et al., 2002)。但在药用植物中超低温保存技术应用则较少，仅有的研究集中于银杏(Ginkgo biloba)(徐刚标等，2001)、半枫荷(Altingia chingii)(刘贤旺等，1996)、地黄(Rehmannia glutinosa)(温学森等，2003)、铁皮石斛(Dendrobium candidum)(陈勇等，2001)等少数物种。本研究中，以2种不同来源的高山红景天愈伤组织为材料进行了超低温保存研究，结果表明：愈伤组织的存活率可达83.24%，且保存后的愈伤组织也很容易诱导成苗。结果表明冰冻保护剂的种类、愈伤组织的继代次数、化冻方式及化冻材料的光照条件对超低温保存后高山红景天愈伤组织存活率有不同程度的影响，这为高山红景天种质资源的离体保存库的建立提供了重要的科学依据。