长鞭红景天(Rhodiola fastigiata)属景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)多年生草本植物，含有红景天甙(salidroside)等多种药用成分，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等功能，对延缓机体衰老、提高脑力和体力劳动机能亦有辅助功效，是一种很有发展前景的环境适应药物(明海泉等，1988；Kurkin，1986；郭燕霞等，2006)，在军事医学、航天医学及运动医学上具有十分重要的价值。长鞭红景天产于西藏喜马拉雅和念青唐古拉山区，常生于海拔3 300~5 400 m的高山灌丛、石砾草坡、冰碛石滩等处(周元川等，1999)。作为藏民族民间草药，在《晶珠本草》、《藏药图鉴》中均有记载，享有“高原人参”的美誉，是西藏红景天属主要药源植物之一。长鞭红景天属可更新资源，但随着中药资源社会需求的不断扩大，其资源危机日趋严重。为加强长鞭红景天野生资源的保护，寻找有效替代品，目前，人们正依循传统栽培(周元川等，1999)和现代生物技术(胡挺松等，2004)2个方面探索该物种的可持续开发利用途径，并对其化学成分(陈金瑞等，1991)及毒理学特性(周元川，2003)进行了分析、评价。作者所在实验室亦从2004年起利用现代生物技术手段，通过植物细胞培养方式，建立起了长鞭红景天的细胞悬浮培养体系(郭燕霞等，2006；苏国庆等，2005)。

植物细胞不仅具有构成一个完整植株的全部遗传信息，同时，在生化特征上，也具有其亲本植株产生次生代谢产物的遗传基础和生理功能。利用植物细胞大量培养技术生产次生代谢物可为天然药物的生产提供一条新途径，现已成为当代生物技术的一个重要组成部分(陈士云等，1993；周俊等，1994；王琴娥等，1994；Fowler，1994；Dornenburg et al., 1995；苏国庆等，2005)。但是，在离体培养条件下细胞的次生代谢与整体植株相比存有一定差异(谢从华等，2004；Avnimelech，2006)，如增殖率低下，产物不稳定(含量低于原植物水平)等，致使多数获取药用有效成分的细胞培养仍然处于培养条件优化阶段。

红景天甙的生物合成属植物次生代谢的苯丙烷类代谢途径。苯丙氨酸解氨酶(pheny中(欧阳光察等，1988)。PAL是一种诱导酶，可受到多种因素的诱导，如低温(Kozukue et al., 1979；Leng et al., 1995)、机械损伤(Leyva et al., 1995；Smith et al., 1979)、病原菌感染(Brown，1991；李爱贞等，1999)、光(Engelsma, 1974；Loschke et al., 1981；Gerbersdorf, 2006)、毒素处理及昆虫取食等都可诱导PAL基因的表达。

本文对不同波长光照处理下的长鞭红景天悬浮培养细胞系，以生物量及关键酶PAL活性为检测指标，研究PAL活性的动态变化规律，并对其影响机制进行了探索，为进一步提高长鞭红景天有效成分产量、优化培养条件提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

长鞭红景天采自西藏自治区林芝地区色季拉山海拔4 200 m以上的高山草甸，以其幼茎作为外植体诱导产生愈伤组织。生长旺盛的愈伤组织继代培养20 d后转入附加有3.0 mg·L^-1 6-BA(6-苄基腺嘌呤)、0.1 mg·L^-1 2, 4-D(2, 4-二氯苯氧乙酸)及3%蔗糖的MS液体培养基中，建立起细胞悬浮培养体系。该培养系主要由淡绿色细胞团组成，最大粒径为4 mm。细胞悬浮培养系每隔10 d继代1次(培养基同上)。培养基初始pH 5.8。培养室内光周期为15 h·d^-1，培养温度为(25±1)℃，摇床转速为109 r·min^-1。

1.2 试验方法 1.2.1 不同光质处理

无菌条件下，准确称取源于同一细胞系、继代10次并性状稳定的悬浮细胞5 g(接种量为10%)，置于含50 mL液体培养基的100 mL三角摇瓶中，(25±1)℃下于不同光质条件中振荡培养，15 d后收获细胞，同一培养条件重复3次。进行黑暗、蓝紫光(400±5) nm、蓝光(440±5) nm、红光(660±5) nm、白光(光量子强度为50~100 μmol·m^-2s^-1的日光灯)等不同光质处理。单色光源采用发光二极管(江苏宜兴兴光电子器件有限公司产)。

1.2.2 生物量测定

收获的小细胞团用5倍体积的蒸馏水充分洗涤3次，抽干表面水分，称其鲜质量(FM, g·L^-1)，后于60 ℃烘箱中烘至恒质量，放入干燥器内冷却，称其干质量(DM, g·L^-1)。

1.2.3 PAL粗提取液制备

采用王敬文等(1981)改进的方法：小细胞团用蒸馏水清洗并抽干水分，每次取样约2.0 g，加0.2 g聚乙烯吡咯烷酮，加10 mL提取液(含5 mmol·L^-1巯基乙醇的0.05 mol·L^-1硼酸盐缓冲液，pH 8.8)，加入少许石英砂，冰浴研磨成匀浆，4层纱布过滤，滤液于4 ℃ 10 000 r·min^-1冷冻离心15 min，取上清液(粗酶液)4 ℃条件下待测定。

1.2.4 PAL活性测定

检测液组成：1 mL酶粗提液，1 mL 0.02 mol·L^-1苯丙氨酸缓冲液(用0.1 mol·L^-1 pH 8.8硼酸盐缓冲液配制)，2 mL蒸馏水，总体积为4 mL。对照不加苯丙氨酸缓冲液，多加1 mL蒸馏水。反应液置于30 ℃温水浴中，反应0.5 h后加6 mol·L^-1 HCl 0.1 mL终止反应。在紫外可见分光光度计(TU-1901, 北京普析通用仪器有限责任公司)290 nm下测OD值，以每小时每毫升酶液OD值变化0.01为1个酶活性单位。

2 结果与分析 2.1 长鞭红景天悬浮培养细胞生长及PAL活性变化的时间进程

无菌条件下称取经继代培养稳定的长鞭红景天悬浮细胞，按10%接种量转移至50 mL MS液体培养基中，于(25±1) ℃白色光照(15 h·d^-1)下悬浮培养。从起始培养起，每3 d取样、称质量，并测定PAL活性。图 1显示，长鞭红景天悬浮细胞生物量随着培养时间的延长呈S型曲线增长方式扩增，6~9 d为细胞迅速增殖的直线生长期，以后生长减慢，并趋向静止。悬浮细胞最大鲜质量(FM)出现在第18天，而最大干质量(DM)则出现在第15天。随着培养时间的推进，细胞干湿比也随之减小。

长鞭红景天悬浮培养细胞PAL活性在21 d的培养周期内亦表现出一定的规律性(图 2)，随着摇瓶内细胞团密度的增大，PAL活性也随之提高，其快速增强期为3~6 d，较细胞快速生长期早，但当细胞培养进入生长停止期时，PAL活性则表现出快速下降的趋势，生长末期时降至与初始水平相当。

2.2 不同光质对长鞭红景天悬浮培养细胞生物量和PAL活性的影响

图 3a显示，长鞭红景天悬浮培养细胞鲜质量在不同光质条件下存有一定差异。白光处理时，细胞鲜质量最大，其次为黑暗处理；400 nm、440 nm和660 nm 3种单波长光照处理对细胞的鲜生物量增长具有一定的抑制作用，其中400 nm的抑制效果最大，其次为660 nm，440 nm的抑制效果较小。方差分析显示，上述3种单色光处理与白光和黑暗处理之间存在显著差异(P < 0.05)，甚至达到极显著性水平(P < 0.01)；同时，400 nm和440 nm 2种短波长光处理与660 nm处理之间亦存在极显著性差异，但是400 nm和440 nm二者之间的差异性并不显著；白光与黑暗处理之间差异显著，但未达到极显著性水平。

图 3b显示，各种光照处理下，长鞭红景天悬浮培养细胞干质量由大到小依次为：白光、440 nm、黑暗、660 nm、400 nm。由此说明，相对于白光处理而言，其他各种光照处理对细胞干质量增长均存在不同程度的抑制作用，其中，400 nm处理的抑制效果(程度)最大，与白光处理之间存有极显著性差异(P < 0.01)，而与440 nm或黑暗处理之间为显著性差异(P < 0.05)。此外，抑制程度稍低的660 nm处理与白光处理之间亦存在显著差异，但与其他光照处理间的差异不显著。黑暗和440 nm处理的抑制作用相对较小，且与白光处理之间亦无显著性差异。

不同光照处理下长鞭红景天悬浮培养细胞系的PAL活性存在差异(图 4)。5种处理中，660 nm红光照射下PAL的活性最高，其次分别为白光、黑暗和400 nm蓝紫光处理，而440 nm蓝光照射下PAL的活性最低，还不到660 nm处理的1/3。方差分析显示，白光和660 nm 2个处理之间，以及黑暗、400 nm和440 nm 3个处理之间均无显著差异，但是前二者与后三者之间则存在着0.01水平的极显著性差异。

3 讨论

室温条件下，长鞭红景天悬浮培养系细胞数量随着培养时间的变化，其扩增生长呈S型曲线，直线生长期为6~9 d，生长速率最大，为0.115 9，最大生物量出现在15~18 d。

PAL在植物苯丙烷类代谢中与植物抗性应激反应密切相关，当植物在逆境胁迫条件下，PAL活性迅速上升，激活苯丙烷类代谢。同时，随着PAL活性的升高，苯丙烷类代谢途径及其下游途径中的某些酶类的活性也会随之升高，如在寡聚半乳糖醛酸酶或2种真菌诱导子诱导下，PAL、4-香豆酸-CoA联结酶、β-葡萄糖苷酶等的活性均能急速上升，且变化规律基本上同步(Bufler et al., 1982)。目前，PAL已作为研究许多植株抗逆能力的一个重要生理指标。

本试验中，PAL活性亦表现出了一定的变化规律。随着摇瓶内细胞密度的逐渐增大，在营养条件、群体密度及培养液容氧量等方面都会产生竞争，造成一定程度的环境胁迫，并随培养时间加剧。PAL活性的快速提高期早于细胞直线生长期，最大值与细胞干质量同步。随后，在细胞进入停止生长时期，因细胞数量及营养亏缺等因素，致使部分个体死亡，加之细胞自身的程序化死亡，最终导致生物量下降。细胞死亡并解体，使大部分水解蛋白酶释放出来，从而导致PAL结构被破坏，活性下降(应初衍等，1984a；Kubasek et al., 1998)。

在不同光质条件下，细胞生物量差异明显。相比而言，白光较黑暗更有利于该细胞系的生长和物质的积累，这可能是细胞团含有部分叶绿素，存在一定程度的光合作用，补给自身的营养水平，促进细胞的快速生长。但是，在短波处理下，细胞的生物量却较黑暗条件有所下降，如蓝紫光辐射处理后，鲜质量、干质量均为最低水平。随着波长的缩短，辐射能加大，对细胞的伤害亦会加剧，加上长时间的辐射处理，最终导致短波长光照下生物量较黑暗下有所下降。

不同光质诱导处理下，长鞭红景天悬浮培养细胞PAL的活性表达亦表现出不同程度的差异。应初衍等(1984b)在尾穗苋(Amaranthus caudatus)上发现各种光都能不同程度地促进PAL活性增加，但蓝紫光的作用效果较弱，白光与红光差异不显著。本文研究结果表明，只有红光与白光对悬浮培养细胞系的PAL活性表达有诱导作用，而蓝光与蓝紫光则存在一定程度的抑制作用，且白光与红光差异不显著。McCue和Conn (1990)观察到，光下(2 000 μE PAR)培养的欧芹(Petroselinum crispum)悬浮细胞的PAL活性是黑暗条件下的3.6倍。Tsukasa等(2000)证明草莓(Fragaria ananassa)悬浮培养细胞系随着光强增大PAL活性明显增强。长鞭红景天悬浮培养体系中PAL活性在光照、黑暗条件下也存在类似的变化趋势。至于在长鞭红景天悬浮细胞培养中，缩短各种光质的辐射时间(即脉冲光照处理)后，PAL活性的变化趋势如何，其中不同光质信号受体(如红光/远红光受体光敏色素、蓝光受体隐花色素等)参与的程度及其信号传导机制，将是今后进一步深入探讨的课题。