兰科植物是高等植物中十分庞大的家族，全世界约有800属，近25 000种(Cribb et al., 2003)。从生物进化的角度来看，绝大多数兰科植物种类正处在进化和特化的活跃期，兰科植物的保护在某种程度上意味着对地球生物多样性未来的保护(罗毅波, 2003)。目前全世界所有的野生兰花种类均被列入了濒危野生动植物国际贸易公约(Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITES)。拯救珍稀濒危物种不仅要对所涉及的物种的野生种进行重点保护，而且需要对物种所在的整个生态系统进行有效的保护。了解兰科植物的生物学及其生态学特性是对兰科植物进行保护的前提。兰科植物的种子数量巨大，一般每个蒴果内都有上万粒种子，最多可达40万粒种子(Arditti et al., 2000)，利用兰科植物种子进行繁殖完全可以达到利用组织培养繁殖的规模(罗毅波等, 2003)；另一方面，兰科植物具有与菌共生的特性，几乎所有的兰科植物都形成菌根，菌根对自然条件下正常生长的兰科植物是必不可少的组成部分。保护兰科植物的多样性除需保持一定数量的植株个体外，保护其共生真菌也是非常重要的(罗毅波等, 2003)。

自然条件下，兰科植物只有与真菌共生才能萌发(Benzing et al., 1981; Arditti et al., 1990)。兰科植物种子与真菌的共生体对研究兰科植物与真菌的相互作用和生物间的协同进化有着重要的科研价值。然而由于兰花种子的微小及其分布的随机性，在种子萌发的最初阶段很难被发现，对其共生真菌的了解也甚少。目前用于种子共生萌发研究多是利用从野生兰科植物的根中分离的真菌(Rasmussen et al., 1993; Masuhara et al., 1994; Currah et al., 1997; Zelmer et al., 1997)，然而野生兰科植物根中的真菌与兰科种子共生的真菌是否相同目前仍是个待解决的问题(Lawrence et al., 2005)。兰科植物种子原地共生萌发技术的应用为上述问题提供了技术保障，是研究兰科植物生物学和生态学特性的一个有力的工具。

目前兰科植物种子原地共生萌发技术已成为国际上开展兰科植物保育，维持兰科植物正常居群常用的一项行之有效的技术，但该技术在我国尚未得到广泛开展。虽然我国有关学者从天麻(Gastrodia elata)、细叶石斛(Dendrobium hancockii)及见血清(Liparis nervosa)原球茎中分离到真菌(徐锦堂等, 1989; 郭顺星等, 1990)，但仍未见有对兰科植物种子原地萌发技术的报道。本文将对兰科植物种子原地共生萌发技术的要点及其应用情况进行介绍，指出该技术应用的关键所在，希望籍此能推动我国兰科植物基于菌根真菌保育工作的开展。

1 兰科植物种子原地共生萌发技术

兰科植物种子原地共生萌发技术是指将兰科植物种子装在特制的袋子中，埋于兰科植株原生境中；一段时间后，通过种子袋观察种子是否萌发，并检验是否有真菌侵染(Rasmussen et al., 1993, 1998; Batty et al., 2001)。兰科真菌通常都是腐生菌(Brundrett et al., 2003)，其来源广泛，主要存在于土壤、枯枝落叶和生物残体，也可能存在于附生兰的寄主上和空气中。存在于野生兰植株根中的共生真菌较易被观察或分离到，但要找出种子共生萌发的真菌和存在于兰植株周围环境中的潜在菌根真菌则非常困难，最有效可行的方法就是利用种子诱导，即种子共生萌发技术(Rasmussen et al., 1993；1998; Brundrett et al., 2003)。

种子的萌发及共生真菌的成功分离是兰科种子原地共生萌发技术的出发点，因此种子袋的设计、兰科植物种子的储备以及自然条件的变化等都是兰科植物种子原地共生萌发技术成功与否的主要影响因素。

1.1 种子袋设计

根据兰科植物种子的体积所特制的袋子，既要阻止种子的流失，又必须允许种子萌发，不妨碍真菌对种子的入侵。可以说种子能否萌发，该技术是否能使用成功，种子袋是个关键因素。Rasmussen等(1993)将种子放于筛孔直径为35 μm的折叠尼龙网中间，用胶片夹进行固定，留一个滑动的开口，既能阻止种子的流失又便于开启观察，另一端系上一条长的尼龙绳用于固定和便于回收。Batty等(2000；2001)在Rasmussen等(1993)研究基础上，将种子与灭菌的白硅砂一起放进尼龙网的种子袋中，避免种子结成团，增加了种子的透气性。Brundrett等(2003)则根据试验需要采用90 μm尼龙网做成长条型的种子袋，并采用热封的方法将种子袋隔成宽2 cm的若干个小袋，能够允许多种不同的兰科植物种子在同一地点进行同步诱导，比较不同兰科植物种子在同一生境中的萌发状况及其共生真菌的异同。由于这种多室种子袋在观察时必须裁开，因此Brundrett等(2003)又提出将种子袋的一面尼龙网改为透明清晰的塑料，观察时只需擦干净塑料上的尘土就行。

1.2 种子采集与活力测定

除了要有合适的种子袋，材料(兰科植物种子)是否充足，质量是否过关亦是兰科植物种子原地共生萌发试验的关键条件，因此在使用原地萌发技术之前就要做好兰科植物种子的采集、收藏以及活力测定。一般先进行人工授粉，然后在合适的时间采集种子(McKendrick et al., 2002)；采集回来的种子用筛子过滤干净，22 ℃下硅胶干燥24 h后，放在密封的容器中，4 ℃保存备用(Batty et al., 2001)；种子的活力测定是种子繁殖和兰科植物保育的一个重要阶段，试验前或试验过程中对种子进行活力测定，既可避免因材料问题而带来错误的试验数据，又可以了解种子在自然条件下存活力。TTC(Triphenyl Tetrazolium Chloride氯化三苯基四氮唑)、FDA(Fluorescein diacetate荧光素二乙酸酯)等化学试剂都被用于兰科植物种子的活力测定(Lakon, 1949; Pritchard, 1985)。Vujanovic等(2000)不仅采用化学试剂TTC、AC(Acid Fuchsin酸性品红)对兰科植物种子的生命力进行测试，还成功地利用真菌Fusarium产生的色素进行种子活力测定和共生萌发试验。

1.3 自然条件的选择

除了需要合适的真菌共生外，种子萌发还需要适宜的温度和湿度。我们很难控制自然环境中的气候变化，但可以采用试验设计和重复试验来使之适应。另外由于真菌是异养的，因此合适的基质即种子袋放置的位置对于种子和真菌共生关系的确定显得尤为重要。试验表明在成年植株周围，枯枝落叶多的土壤中放置种子袋有利于种子的萌发(McKendrick et al., 2000; Batty et al., 2001)。

2 兰科植物种子原地共生萌发技术的应用 2.1 种子生物学研究

自然界中，兰科植物种子只有与真菌共生才能萌发。兰科植物种子原地共生萌发技术的应用，完善了我们对于兰科植物生活史的研究，可以帮助我们了解维持该物种生存的生态环境及其生活史不同阶段所需的最佳生境，能够提供贴近自然的数据，能够调查一些异地萌发所不能研究的问题，如土壤中种子库的动态(Batty et al., 2000；Rasmussen et al., 1993；1998)。通过运用兰科植物种子原地共生萌发技术，Rasmussen(2002)提出了自然界中兰科植物从种子与真菌共生萌发到成为具有菌根的植株的过程，并指出兰科植物在继续生长并达到成熟之前需经历一段休眠期。

运用兰科植物种子原地共生萌发技术，Whigham等(2006)首次大规模对兰科植物种子在自然条件下基质中的存活率进行了测试，试验结果表明几种兰科植物种子在7年之后仍然具有活力；其中Liparis liliifolia在4年后室内伴菌播种仍能获得高达68%的萌发率。该研究对于兰科植物的保育具有重大的意义，一些濒临绝种或已经消失的兰科种类，或许可以依靠原生境中存在的种子库进行复苏(Kull et al., 2006)。Hollick (2004)应用原地共生萌发技术对澳大利亚野生兰(Caladenia arenicola)进行真菌诱导，在获得真菌后又在土壤中进行兰科真菌的重新接种。原地种子共生萌发的成功，表明回接的真菌能够在土壤中存活并具有一定的持久性。兰花生境中的潜在种子库加上适当真菌的回接为濒临绝种的兰科植物保育开辟了一条新的可行途径。

2.2 种子共生真菌的诱导

目前，部分兰科植物种子的无菌播种已获得成功，但大部分兰科植物种子在无菌条件下仍很难萌发。室内有菌和无菌播种表明：兰科植物种子有菌播种比无菌播种的萌发率高，且幼苗成活率和后续生长优于无菌播种(Markovina et al., 2000; Takahashi et al., 2001)，因此将真菌应用于兰科植物的种子繁殖中将成为育种工作者的一个重要研究方向。如何获得最有效的真菌是种子能否获得高萌发率的关键。目前用于种子共生萌发研究所用的真菌多是从兰科植物根中分离的，兰株根中可能含有对种子萌发有益的真菌和大量作用未知的内生真菌，这使得有益真菌的筛选工作变得复杂而繁琐。且从兰科植物成年植株的根中获得的真菌并不一定能促进种子的萌发(Hollick, 2004)。利用兰科植物种子原地共生萌发技术从萌发的原球茎中分离真菌，能够获得最早接触种子并促进种子萌发的有益真菌。

2.3 濒危兰科植物的保育

所有的兰科植物在其生活史的某个阶段，甚至是整个生活史都依靠菌根提供营养，从某种意义上来说菌根真菌成了兰科植物的寄主(Zettler, 1997; Brundrett, 2002)。合适的共生真菌的缺乏或丧失是兰科植物濒危的一个重要的原因。因此了解自然界中菌根真菌的分布及其与兰科植物之间的相互作用对濒危兰科植物的保育意义重大。

共生真菌是影响兰科植物的分布和生存的主要因素(Clements, 1988; Bayman et al., 1997)，兰花幼苗生长在时间和空间上的变动存在于兰科植物种间甚至是个体间，这与真菌分布的随机性有很大的相关性(Batty et al., 2001；McKendrick et al., 2002)。许多兰科植物的物种只能在特定的环境中生存。原地共生萌发试验表明：无论是兰科植株，还是真菌都需要合适的生存环境才能建立起适宜的共生关系(Rasmussen, 2002)。兰科植物种子原地共生萌发所获得的结果将有助于解释兰科植物的生态学特性。

兰科植物与真菌共生的专一性一直是个备受争议的问题。兰科植物在不同生长阶段所具有的共生真菌是否相同？兰科植物与真菌在室内试验中所表现的专一性程度与自然条件下的是否相同？兰科植物种子原地共生萌发技术的应用填补了自然界中种子共生萌发的研究空白，有助于对兰科植物与共生真菌专一性问题的研究。试验结果表明真菌与兰科植物种子在自然条件下和实验室条件下表现出不同的专一性(Masuhara et al., 1994; Perkins et al., 1995)。通过兰科植物种子原地共生萌发技术了解有益真菌的分布以及自然界中真菌与兰科植物的专一性，可作为真菌重引入和兰花潜在生境选择的重要依据，为维护或重建兰花种群提供可行的基础保障。

3 展望

由于自然界试验地点的限制和兰科植物生物学特性的影响，种子原地共生萌发技术应用中出现的几个问题应充分考虑到试验方案的设计中去，如种子袋的通透性和牢固性、种子活力、气候影响、人以及其他动物干扰等。针对上述问题，在进行兰科植物种子原地共生萌发之前，先要进行生境调查，选择合适的样地，根据试验目的进行合理的设计。同时要对寄主兰花的生物学特性有一定的研究，以便了解种子的采集时间和兰花的生长季节等。最后还需从当地的气象局了解气候的变化规律，选择并把握好试验的最佳时期，做好重复试验的准备。

基于种子原地共生萌发技术的有效性和实用性，该技术已经成为国际上对兰科植物保育和兰科菌根真菌研究的重要手段。无论是兰科植物共生真菌资源的收集，还是兰科植物种子生物学的研究、兰科植物菌根生态学的研究，原地共生萌发技术都是一项行之有效的技术。除了上述研究，兰科种子原地共生萌发技术还有广阔的应用前景，目前兰科植物种子原地共生萌发技术仅在地生兰中得到应用，然而只需改进种子袋“固定”的方法，该技术在附生兰的菌根真菌研究中也存在着巨大的应用潜力。另外，兰科植物种子原地共生萌发技术还有助于兰科植物生物多样性的保护。生物多样性保护需要重视食物网结构以及理解什么样干扰会改变它们的结构和功能，这一领域的研究包括菌根真菌的作用。生产力水平和生产力多样性都与土壤中菌根真菌的水平相关，所有物种对生态系统的结构和功能都是重要的，保护生态系统应强调保护其完整性以及每个单个的物种(Moore et al., 1993)。目前我们对于兰科植物菌根真菌的研究主要集中于它们与兰科植物的共生关系，相对缺乏它们对兰科植物在生态系统中生存和分布影响的研究，加强这方面的研究也许有助于解释和解决一些兰科植物濒危的现状。兰科植物种子原地共生萌发技术的提出和应用为这方面的研究提供了技术支持。