文章信息
- 段新芳, 曹远林, 曹永建, 周冠武, 陈永圣, 朱家琪, 赵保路.
- Duan Xinfang, Cao Yuanlin, Cao Yongjian, Zhou Guanwu, Chen Yongsheng, Zhu Jiaqi, Zhao Baolu.
- 漆酶活化处理对木材自由基变化的影响
- Changes of Intensities of Reactive Oxygen Species (ROS) Free Radicals from Laccase-Treated Woods
- 林业科学, 2007, 43(4): 134-136.
- Scientia Silvae Sinicae, 2007, 43(4): 134-136.
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文章历史
- 收稿日期:2005-11-10
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作者相关文章
2. 中国科学院生物物理研究所 北京 100101
2. Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences Beijing 100101
漆酶是一种氧化还原酶,能催化许多有机化合物和少数无机离子进行反应,具有降解木素, 可与有毒的酚类物质作用, 使苯氧基类除草剂、石油工业废水去除毒性等作用, 近年来在造纸、饮料加工、环保等方面得到广泛的研究与应用(Yaropolov et al., 1994),其中可以利用漆酶活化处理,使木材中的木质素活化,产生胶合作用,用来黏结木纤维或木刨花,生产人造板。国外对漆酶活化处理木材已经进行了较多的研究,并取得了一定进展(曹永建等,2005)。Febly等(1997)用漆酶氧化山毛榉(Fagus longipetiolata)木纤维,室温下加入3 μg酶蛋白·g-1纤维,酶处理1 h,干燥后,200 ℃热压成3 mm的纤维板,其抗弯强度(MOR)为40.3 MPa,而抗弯弹性模量(MOE)为4.10 MPa, 尺寸稳定性极好;Viikari(1998)用漆酶处理木纤维生产的纤维板,内结合强度超过0.9 MPa,拉伸强度提高了38 MPa;朱家琪等(2004)用湿法纤维板生产工艺,对漆酶处理木纤维生产纤维板进行试验研究,结果表明:用漆酶处理木材纤维,可以赋予木材自身胶合力,纤维板的内胶合强度(IB)超过1.0 MPa。漆酶处理木材纤维并产生胶合作用,主要是因为酶活化产生的自由基起作用,但对漆酶活化木材产生的自由基种类、木材自由基的变化影响及其胶合机理都缺乏研究。本文采用漆酶活化处理木材,利用电子自旋共振(electron spin resonance, ESR)波谱仪测定漆酶处理前后木材自由基的种类及其变化,探讨漆酶处理条件对木材自由基形成变化的影响,为揭示漆酶活化处理木材产生胶合作用机理提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料木材试样为枫香(Liquidambar formosana)、思茅松(Pinus kesiya var. langbianensis)边材和心材木粉(60~80目),漆酶为中国科学院微生物研究所制备(酶活19 U·mL-1)。分析用试剂有:醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH值为3.47和6.50)、自旋捕捉剂N叔丁基-α-苯基硝酮(PBN, N-tert-butyl-α-phenylnitrone)(Sigma公司产品)、乙酸乙酯等。
1.2 方法选用枫香、思茅松边材和心材3种木材试样,采用仅加去离子水作为对照以及漆酶处理进行试验。各试样处理步骤如下:对照,取各种木粉45 mg放入不同离心管中,分别加入去离子水450 μL、自旋捕捉剂PBN溶液50 μL、0.04 mol·L-1(终浓度为2.2 mmol·5L-1); 漆酶处理,取各种木粉45 mg放入不同离心管中,分别加入漆酶液450 μL、2种pH值(3.47、6.50)缓冲液450 μL和自旋捕捉剂PBN溶液50 μL、0.04 mol·5L-1(终浓度为2.2 mmol·5L-1)。
将添加了各种处理试剂的离心管放入水浴锅中,32 ℃下反应2 h后,取出迅速放入碎冰中,再分别加入300 μL乙酸乙酯到各离心管中用于萃取,振动100~120 s,使之充分混匀,然后离心4 min(9 000 r·min-1),使离心管中的悬浮液分层,用微量进样器吸取上层清液,并立即进行ESR测定。
电子自旋共振波谱仪为德国产Bruker ER200D-SRC, X-band。测试条件为:中心磁场,3 385 G;扫描宽度,400 G;调制幅度,3.2 G;增益,400 000;微波功率,20 mW。
每个试样进行3个重复的测定,以3个重复的平均值作为该样品的平均值。自由基的相对浓度计算方法是测量ESR图谱中的峰高,以其平均值作为该样品的自由基浓度。
1.3 数据分析试验数据以(x±s)表示,将3次重复的试验结果进行方差分析,P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 未加漆酶和加漆酶处理木材的ESR图谱活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基是一大类自由基的总称,反应活性大、氧化能力强,包括超氧阴离子自由基O
从图 1可见,未处理枫香木材的ESR图谱为典型的无超精细分裂的粉状图谱,与Felby等(1997)得到的木纤维ESR谱图相同。其g值为2.003 8,与酚氧自由基的g值相同;根据Capani等(2001)的研究结果,一般活性氧类自由基ESR谱图为3到6线峰。从图 2漆酶活化处理枫香木材的自由基谱图可见,与图 1明显不同,属于典型的活性氧类自由基ESR谱图,其g值为2.005,aN=15.0 G。
如图 3所示,与对照(16.87±1.69) mm相比,pH 3.47的漆酶处理后,枫香木材ROS自由基浓度[(33.23±4.8) mm, P < 0.01]升高了97%;pH 6.50的漆酶处理后,ROS自由基的浓度[(23.03±4.93) mm, P=0.11]升高了36.6%,表明pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.50时的好。单因素方差分析表明, pH值对漆酶处理枫香木材产生自由基的浓度差异极显著(P < 0.01, 图 3)。
如图 3所示,与对照组(62.7±15.62) mm相比,经pH 3.47的漆酶处理后思茅松边材悬浮液中ROS自由基的浓度[(138±12.29) mm, P < 0.01]升高了120%;经pH 6.50的漆酶处理后ROS自由基的浓度[(70.9±7.82) mm, P=0.46]升高了13%, 表明pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.50时的好。单因素方差分析表明, pH值对漆酶处理思茅松边材ROS自由基的浓度差异极显著(P < 0.01, 图 3)。同理可得出,与对照组(53.43±4.5) mm相比,pH 3.47的漆酶处理后思茅松心材ROS自由基的浓度[(135.67±15.8) mm, P < 0.01]升高了154%;pH 6.50的漆酶处理后ROS自由基的浓度[(64.2±3.55) mm, P < 0.05]升高了20%, 表明pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.50时的好。单因素方差分析表明, pH值对漆酶处理思茅松心材产生ROS自由基浓度差异极显著(P < 0.01, 图 3)。
pH值大小对漆酶活化木材自由基浓度影响显著,其原因与酶催化处理的条件和酶活性高低有关,酶活过低或过高都有可能抑制木材活性氧自由基的产生,从而降低酶的催化氧化效率。漆酶在较低的pH值下,其活化效率最佳。因此,pH 3.47比pH 6.50条件下,活化木材的ROS自由基浓度高。
2.4 漆酶处理后自由基浓度的变化比较与讨论如图 4所示,思茅松边材ROS自由基的浓度最大,思茅松心材的次之,而枫香木材的最小。单因素方差分析表明,不同树种木材ROS自由基浓度差异极显著(P < 0.01,图 4)。这说明漆酶处理产生ROS自由基与树种密切相关,思茅松边、心材漆酶处理效果优于枫香木材,而漆酶处理对思茅松心、边材产生ROS自由基的大小没有显著性影响。
漆酶活化木材能产生木材ROS自由基,其活化实质是激活木材中木质素上的自由基。思茅松边材及心材、枫香木材漆酶活化处理后不同树种间有显著差异,这主要与木材中的木质素含量大小密切相关,木材化学组分分析表明,思茅松边材及心材的木质素含量比枫香木材明显要高,思茅松木质素含量为28.55%,而枫香的木质素含量为24.25%(李坚,1998)。
3 结论1) 未处理木材的自由基为酚氧自由基,而漆酶处理木材产生了活性氧类(ROS)自由基。2) 漆酶处理3种木材均能产生ROS自由基, 且pH 3.47时漆酶处理效果比pH 6.50时的好。3) 漆酶处理产生ROS自由基与树种密切相关,思茅松边、心材漆酶处理自由基强度高于枫香木材,而漆酶处理对思茅松心、边材产生ROS自由基的强度没有显著影响。这表明漆酶活化木纤维生产纤维板时应根据具体木材树种确定相应的处理条件。
曹永建, 张双保, 段新芳, 等. 2005. 漆酶特性及其在林产工业中的应用进展. 世界林业研究, 18(3): 59-62. DOI:10.3969/j.issn.1001-4241.2005.03.013 |
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Cao Yuanlin, Guo Ping, Xu Yangcang, et al. 2005. Simultaneous detection of NO and ROS by ESR in biological, systems. Methods in Enzymology, Elsevier Inc, 396: 77-83. DOI:10.1016/S0076-6879(05)96008-4 |
Capani F, Loidl C F, Aguirre F, et al. 2001. Changes in reactive oxygen species (ROS) production in rat brain during global perinatal asphyxia: an ESR study. Brain Res, 914(1-2): 204-207. DOI:10.1016/S0006-8993(01)02781-0 |
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Yaropolov A I, Skorobogatko O V, Vartanov S S, et al. 1994. Laccase-properties, catalytic mechanism, and applicability. Appl Biochem Biotechnol, 49(3): 257-280. DOI:10.1007/BF02783061 |
Viikari L. 1998. Lignin-based adhesives and a process for the preparation thereof. WO 98/31763
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