石榴(Punica grantum)是山东省枣庄市重要的经济林树种，是当地农民脱贫致富的经济支柱。近年来石榴病害严重发生，制约着当地石榴产业的发展。据文献报道，影响我国石榴发展的主要病害有石榴疮痂病、石榴干腐病和石榴褐斑病等(谌多仁等，1985)。但笔者发现：发生于枣庄石榴枝干和果实上的溃疡类病害，虽然出现了类似于疮痂和干腐的症状，但病原与以前报道的不同，为石榴新病害。笔者从1996年起对该类病害的病原进行了研究(刘会香等，2001a；2001b)，发现其病原均为Dothiorella属真菌，但病害症状差异很大。为搞清病害病原菌与症状的关系，深入研究这3种病原菌的系统关系，从而为病害的防治提供科学依据，笔者就石榴疮痂病、石榴干腐病及果实上的病原菌进行了系统研究。

1 材料与方法 1.1 材料来源

1996—2000年每年春、夏、秋、冬季分别从枣庄采回石榴疮痂病病枝、石榴病果、石榴干腐病病枝并进行病原菌分离、培养，4 ℃保存待用。

1.2 方法 1.2.1 3菌株形成病害症状的比较研究

采用定期采样的方法，详细观察和记载病斑发生的部位、症状出现的时间、病斑的扩展规律、特点等。

1.2.2 3菌株病原菌形态学比较研究

采用室内外相结合的方法，研究病原菌的子实体特征，包括分生孢子器和分生孢子的大小、颜色形状等分类学特征。

1.2.3 3菌株培养性状及生理学特性的比较研究

1) 不同温度对3菌株培养学性状及生长的影响  将已纯化培养3~5 d的3菌株接种于PDA培养基上，分别置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃ 8个梯度的恒温箱中培养，每天观察3菌株菌丝的扩展速度、菌丝的茂密程度、菌落的颜色变化等特征。重复5次。

2) 不同pH值对菌丝体生长的影响  用0.1 mol·L^-1 NaOH和0.1 mol·L^-1 HCL将培养基值分别调节为3、4、5、6、7、8、9、10共8个pH梯度，将纯化培养3~5 d的菌株接种其上后，置于25 ℃的恒温箱中培养，每天观察菌落的生长状况。重复5次。

3) 不同碳、氮源对菌丝体生长的影响  以利里(Lilly)和贝奈特(Barnett)的半组合培养基做基础培养基，分别用麦芽糖、乳糖、蔗糖、d-果糖、淀粉5种碳源将半组合培养基中的葡萄糖置换，制成各种不同碳源培养基，然后将已培养于PDA培养基中3~5 d的菌株接种于各种不同碳源培养基上，置于25 ℃的恒温箱中培养，每天观察菌落的生长状况。不同氮源培养基分别用硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏、蛋白胨与半组合培养基中的天门冬素置换，具体方法同碳源试验。所得数据用SPSS 12.0软件进行处理。

1.2.4 3菌株的RAMs-PCR比较研究

1) 3菌株的DNA提取  将PSA液体培养的3菌株培养10 d后收集菌丝，菌丝经灭菌水冲洗3次洗净后保存于-20 ℃备用。DNA提取方法主要参考Zhu等(1993)的方法，并做部分改进(张星耀等，1999)。

2) RAMs-PCR扩增及产物电泳  选用的通用微卫星引物序列及其退火温度见表 1。引物由北京九发金贝生物技术有限公司合成，Taq酶购自鼎国生物技术有限公司。RAMs-PCR反应体系见表 2。反应体系中最后加入20 μL矿物油以防止反应液蒸发。扩增条件为94 ℃变性2 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，延伸72 ℃ 45 s为1个循环，共35次循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增反应在GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行。每一引物重复3次，以不加模板DNA为阴性对照。扩增产物在5%和8%的聚丙烯酰胺凝胶及120 V电压下进行电泳，采用硝酸银染色法显色。

3) RAMs-PCR产物电泳数据的处理  将聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱输入计算机，利用凝胶分析软件BandScan5.0 (Glyko, inc. 1998)对电泳条带进行识别，小于10 bp被认为属于同一条带。根据某一条带在样品中出现和不出现，分别赋值为“1"和“0"，得到试验菌株的扩增谱带二态数据矩阵并根据Nei(1987)的方法计算相关菌株的相似系数I，I=2N_ij/(N_i+N_j)，其中N_i、N_j为两样品的总显示带数，N_ij为两样品共有的显示带数，距离D=1-I。用NJ(neighbor-joining)分别对所有菌株进行聚类。相似系数的计算和聚类分析均由Ntsys2.02分析软件完成。

2 结果与分析 2.1 病害症状的比较 2.1.1 石榴干腐病

症状出现较早，一般出现在3月底至4月初，病斑多发生在1年生或多年生枝干部的皮孔或伤口处，初期发病部位松软，病斑较小，圆形，下陷，颜色较深，后期病斑沿树体纵向扩展、下陷，并与健康组织间有明显边缘，小枝常出现枯死。其上后密生小点(图 1a)。

2.1.2 石榴疮痂病

症状出现较晚，一般在5、6月份，病斑多发生在2年生以上枝干部的皮孔处，而在1年生枝条上比较少见。病斑初为圆形或椭圆形，隆起，而后，病斑逐渐扩大，形成不规则形，大小不一，严重时多个病斑连在一起，并使表皮发生龟裂，粗糙坚硬，甚至露出韧皮部或木质部，致使树体生长势衰弱(图 1b)，但不出现坏死症状。

2.1.3 石榴果实部位症状

病斑一般在花期的花萼处或其他部位出现黑色的圆形小点，随后随着果实的增大，在果实上出现大的黑色的病斑，使果皮表面粗糙，严重时造成果皮龟裂或果实瘦小，甚至出现坏死。严重影响果实的品质、产量和观赏价值(图 1c)。

2.2 病原菌的形态特征比较

3菌株的子座均球形或扁球形，黑色炭质，大小不一；分生孢子器不规则形，单生、双生或聚生在子座内，黑色，其大小有差异，发生于果实部位的病菌的分生孢子器较大；分生孢子单孢、无色梭形，其长宽比分别为病果(4.37)>疮痂病(3.77)>干腐病(2.9)。见表 3、图 2。

2.3 3菌株的生理学特性比较研究 2.3.1 不同温度对3菌株培养学性状及生长的影响

3菌株菌丝在PDA培养基上生长，初期均出现无色呈放射状向四周扩展，菌落近圆形，边缘整齐，菌丝茂密，气生菌丝很发达，3 d后，菌丝颜色逐渐变深，最后变为灰色或黑色。9 d后逐渐产生子座，半埋于培养基中，黑色或深灰色，在湿度比较大时，有乳白色分生孢子角溢出。其生长特性见表 4。从表 4可以看出：3菌株的生长对不同温度很敏感，通过Duncan检验(未列出)，3菌株均在20~35 ℃生长良好，其他温度生长较缓慢，在相同的温度下3菌株的生长无明显差异。

2.3.2 不同pH值对菌丝体生长的影响

结果见表 5。表 5表明:不同pH对3菌株的生长影响很大，呈显著差异，而不同菌株间的生长差异不大。通过Duncan检验(未列出)，3菌株均在pH 5~7范围内生长迅速。

2.3.3 不同碳、氮源对菌丝体生长的影响

结果见表 6。表 6表明：不同C/N源对3菌株的生长影响很大，Duncan检验表明(未列出):3菌株前3 d在牛肉膏N源培养基上生长最好，其次是蛋白胨培养基，在碳源培养基上生长不好，4 d后3菌株在蔗糖培养基上生长良好，而在牛肉膏等氮源培养基生长渐慢，说明3菌株在生长的早期，对氮源的需求量较多，而在后期对碳源的需求量较多。3菌株在相同培养条件下的生长没有明显的差异。

2.4 3菌株的RAMs-PCR电泳分析

应用GT、CGA、CCA、GAA、CAA、GA和M13等7种引物进行了3菌株的RAMS-PCR扩增，其电泳结果和相似矩阵见图 3和表 7。从RAMs-PCR电泳图谱和相似矩阵可以看到3菌株的亲缘关系很近。但三者进一步比较，发现石榴疮痂病病原菌与石榴果实上的病原菌具有更近的相似性，说明它们的亲缘关系更近一些；而石榴干腐病病原菌与其他两者病原菌相似性较小一些，说明它们的亲缘关系较远一些。

3 结论与讨论

发生于山东枣庄石榴枝干部位的疮痂病和干腐病是近年来石榴上的重大生物灾害，已造成严重的经济损失，特别是石榴干腐病危害更大，常常造成整个毁园。笔者在研究中发现尽管两者的病原形态学鉴定为Dothiorella(刘会香等，2001a；2001b)属真菌，但发病时间和症状特点差异很大，另外果实上的症状由石榴疮痂病还是由石榴干腐病病原引起，一直没有明确的答案。本研究通过对3菌株所表现的病害症状及其出现时间、形态学特征、培养学特征、生理学特性及RAMs-PCR扩增等方面，系统研究了三者之间的关系。

从病害发生的症状特征来看，发生于石榴枝干上的疮痂病和果实上的症状均出现增生型的症状，而发生于石榴枝干部的干腐病属于坏死型的症状；说明它们症状形成的机理是不同的；从病害症状出现的时间相比，石榴干腐病发病时间较早，一般在比较寒冷的时期就出现，而石榴疮痂病和果实部位的病害症状均出现较晚，一般在石榴开花的时期开始出现，说明病原菌对温度的需求是不同的，石榴干腐病菌能够忍耐低温，但研究表明：三者在不同温度下的生长趋势一致(刘会香等，2005)，这说明石榴干腐病的病原菌可能具有比较复杂的温度适应机理。

从3菌株的培养学特性、形态学特性和生理学特性比较可以看出：三者没有显著的差异，说明他们之间的亲缘关系比较近，通过应用7种不同的引物进行RAMs-PCR扩增，发现石榴疮痂病与石榴果实部位的病原亲缘关系更近。

石榴疮痂病与石榴果实上的增生型症状的病原菌具有更近的亲缘关系，应为同一病原引起，推测该病原首先侵染石榴侵染枝干，然后侵染石榴的花萼和果实；而石榴干腐病病原菌主要侵染枝干，是否也侵染果实及引起的症状需要继续进行研究和鉴定，以便为病害防治策略的提出提供重要的依据。