为固定天然杂交、人工杂交以及突变后经人工选择的优良基因型，无性系育林已成为林木遗传改良的一种重要手段(施季森等，1994)。然而，无性繁殖的年龄效应是影响无性系育林的主要障碍之一，为克服年龄效应，人们对不同树种的采穗母株采取伐桩促萌、修剪、连续继代扦插、幼砧连续嫁接、组织培养、化学调控等复壮措施，获得了较好的复壮效果(季孔庶等，1996)。桉属(Eucalyptus)中的巨桉(E. grandis)、尾叶桉(E. urophylla)及其杂交种因其生长快、用途广泛、经济效益好等优点得以在华南地区广泛引种。据不完全统计，广西每年营造桉树人工林10万hm²左右，其中无性系林占95%以上，每年所需桉树扦插苗超过1亿株。如何避免桉树无性繁殖苗木出现生长及抗性衰退的问题已经引起林木遗传工作者的关注(谭健晖, 2003；杜盛，1995)。桉树无性繁殖年龄效应方面已有少量报道，谭健晖等(2007)通过对巨尾桉(E. grandis×E. urophylla)插穗年龄分别为1、2、3年的扦插苗的生长及抗病性衰退进行研究，发现随着采穗母株使用年限的延长其扦插苗的生长及抗病性呈现不断衰退的趋势；方良等(2004)对桉树U6无性系经过复壮及长期不复壮2种组培苗做采穗母株进行扦插试验，认为经过复壮的组培苗做采穗母株其出穗量、根系数量、扦插成活率及苗期生长均优于不经复壮的组培苗做采穗母株。但通过幼林叶片的抗氧化生理等动态变化研究有关采穗母株年龄对扦插繁殖的不同影响以及影响的量化程度至今末有报道。本研究从叶片抗氧化生理着手，研究巨尾桉扦插繁殖的年龄效应以及不同复壮措施的叶片生理变化规律及复壮效果。

1 材料与方法 1.1 材料

参试材料以巨尾桉广林9号无性系第15代组培苗为采穗母株，采集1、2和3年生的母株(矮桩修剪)穗条培育扦插苗，每处理定植采穗母株1万株。插条年龄分别为13、26和38个月(分别简称为1、2和3年生)，共3个处理，每个处理扦插63株，扦插于8 cm×12 cm聚乙烯营养袋中，培养3个月，各处理选择苗木生长一致的20株定植造林，造林时平均苗高为30.3 cm。巨尾桉广林9号由广西林业科学研究院选育。

1.2 方法

于2005年9月至2006年7月在广西林业科学研究院桉树生产基地内进行。每个处理定植20株，株行距为2 m×1.5 m，坎规格为30 cm×30 cm×40 cm，不施基肥。土壤类型为赤红壤，土壤肥力中等。

叶绿素含量测定：称取剪碎+3轮枝条东、南、北3个方向的混合叶片0.1 g(除去叶脉)于25 mL容量瓶中，加提取液在黑暗条件下浸提24 h至叶肉变白，测定OD663、OD645和OD470值，然后按Arnon分式计算叶绿素含量。

可溶性蛋白含量测定：参照考马斯亮蓝G－250染色法进行测定(李合生, 1999)。

丙二醛含量的测定：参照硫代巴比妥酸法进行测定(李合生, 1999)，再按赵世杰等(1994)的改进分式计算丙二醛含量。

过氧化物酶活性测定：参照愈创木酚方法测定(李合生, 1999)。

过氧化氢酶活性测定：酶液的提取与过氧化物酶液的提取相同，反应系统为2 mL 0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH 7.8)，1 mL 0.08% H₂O₂和0.2 mL酶液，以磷酸缓冲液作为空白，用石英比色皿，每15 s测一次OD240值，共测3 min。

超氧物歧化酶活性测定：参照氮蓝四唑法测定(李合生, 1999)。

游离脯氨酸含量的测定：应用磺基水杨酸法测定(张殿中等，1990)。

以上生理指标的测定均重复3次，异常数据进行剔除。

1.3 数据分析与处理

分别对3种处理的叶绿素含量、可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性、CAT活性、MAD含量、PRO含量进行方差分析(SPSS软件)。

2 结果与分析 2.1 插穗年龄与叶绿素含量变化

同一采穗年龄叶片叶绿素含量变化大体相同，都是随着树龄增加而降低(图 1)。7月龄时各幼林的叶绿素含量较高，其中3年生最高，其次是2年生，最低的是1年生。随着巨尾桉的生长发育，叶绿素含量逐渐下降，8—9月龄下降缓慢，9—10月龄叶绿素含量下降速度加快，至10月龄时降到最低水平。说明7月龄出现衰老现象，9—10月龄衰退加剧。各处理叶片的叶绿素含量差异达极显著水平(表 1)。1、2和3年生10月龄的叶绿素含量比7月龄分别下降41.69%、48.41%和54.40%，叶绿素含量降低最快的是3年生；不同采穗年龄其叶绿素平均含量按高低排列为：1年生＞2年生＞3年生，即采穗母株年龄越小，叶绿素含量越大。

2.2 插穗年龄与可溶性蛋白质含量变化

同一采穗年龄叶片的可溶性蛋白含量变化大体相同，都是随着树龄的增加而降低(图 2)。7月龄时各处理可溶性蛋白含量较高，其中1年生最高，其次是2年生，最低是3年生。随着树龄的增加，可溶性蛋白含量逐渐下降，7—8月龄时下降缓慢，8—9月龄时各处理下降速度加快，至9—10月龄可溶性蛋白含量迅速下降，10月龄时降至最低水平，说明7月龄时出现衰老现象，并随着树龄的增加衰退加剧。各处理的可溶性蛋白含量差异达极显著水平(表 1)。1、2和3年生10月龄的可溶性蛋白含量比7月龄分别下降50.06%、48.64%和60.00%，可溶性蛋白含量降低最快的是3年生。不同采穗母株年龄的可溶性蛋白平均含量按高低排列为：1年生＞2年生＞3年生，即采穗母株年龄越小，可溶性蛋白含量越大。

2.3 插穗年龄与POD活性变化

同一采穗年龄叶片的POD活性变化如图 3所示。随着树龄的不断增加，叶片的过氧化物酶活性呈明显地先下降后升高的趋势，但降至POD活性最低值的树龄不同，3年生在8月龄时出现最低值，2、3年生在9月龄时出现最低值，POD活性最高值均出现在7月龄。3年生在8月龄时出现衰老胁迫，植株启动POD酶，以消除活性氧对细胞膜的伤害，2、3年生在9月龄出现类似现象，比3年生出现衰老胁迫平均晚1个月。各处理叶片POD活性差异达极显著水平(表 1)。7月龄时POD活性最高为1年生，其次为2年生，最低为3年生。1、2和3年生10月龄的过氧化物酶活性比7月龄分别下降14.47%、13.40%和7.90%。不同采穗母株年龄的叶片POD平均活性按高低排列为：1年生＞2年生＞3年生，即采穗母株年龄越小，叶片POD活性越大。

2.4 插穗年龄与SOD活性变化

同一采穗年龄叶片的SOD活性变化如图 4所示。随着树龄的不断增加，SOD活性总体上都呈下降的趋势，但有不同的变化。1年生有明显地先降低后增加的趋势，虽在9月龄时出现另一峰值，但活性仍低于7月龄时的活性，说明此时衰退加剧，SOD酶开始启动保护系统，以减轻衰退的程度和速度。其余各处理都呈逐渐下降的趋势。不同处理叶片SOD活性差异达极显著水平(表 1)。7月树龄时各处理SOD活性较高，其中1年生最高，随着巨尾桉的生长发育，各处理的SOD活性逐渐下降，除1年生外其他处理7—8月龄时均缓慢下降，9—10月龄时SOD活性下降速度加快，至10月龄时降到最低水平。1、2和3年生10月龄的SOD活性比7月龄分别下降31.63%、37.93%和51.68%，SOD活性降低最快的是3年生，为51.68%。不同采穗母株年龄的平均SOD活性按高低排列为：1年生＞2年生＞3年生，即采穗母株年龄越小，SOD活性越大。

2.5 插穗年龄与CAT活性变化

同一采穗年龄叶片的CAT活性变化如图 5所示。随着树龄的不断增加，CAT活性有不同的变化，1年生呈下降低的趋势，2、3年生先略下降后升高。1年生CAT活性速降期均出现在7—8月龄，而2、3年生的速降期出现在9—10月龄，之后CAT活性缓慢下降，3年生的CAT活性最大值在9月龄，其余处理均出现在7月龄。各处理的叶片CAT活性差异达显著水平(表 1)。7月树龄时各处理CAT活性1年生最高，其次是2年生，最低的是3年生，1、2和3年生10月龄的CAT活性比7月龄分别下降24.35%、17.50%和21.05%。不同插穗年龄的CAT平均活性按高低排列为：2年生＞1年生＞3年生，插穗年龄与CAT活性间无明显关系。

2.6 插穗年龄与MAD含量变化

同一采穗年龄其叶片的MAD含量变化如图 6所示。随着树龄的不断增加，MAD含量均呈不同程度的增加，并在8月龄和10月龄时出现2个峰值，8月龄时MAD含量逐渐增加，10月龄时显著上升，并在10月龄时出现最大值，说明在衰老期间，MAD的含量变化是巨尾桉质膜损伤程度的重要标志之一，8月龄时植株已对衰老胁迫产生了一定的防御反应，使细胞膜得到修复，随着衰老的进一步加深，巨尾桉出现更严重的逆境胁迫，至使MAD含量急剧上升，这与水稻(Oryza sativa)、花生(Arachis hypogaea)的研究一致(林植芳等，1984；戴良香等，2004)。各处理的叶片MAD含量差异达极显著水平(表 1)。10月龄时各种处理MAD含量较高，其中3年生最高，其次是1年生，最低的是2年生。不同采穗母株年龄的MAD平均含量按高低排列为：3年生＞2年生＞1年生，即采穗母株年龄越小，质膜过氧化产物MAD的含量越小。

2.7 插穗年龄与PRO含量变化

同一采穗年龄叶片的PRO含量变化如图 7所示。随着树龄的不断增加，PRO含量的变化大体相似，先升高后降低。说明在衰老期间，叶片不断积累PRO以增加抗衰老能力。3种处理出现峰值的树龄不同。各处理的叶片PRO含量差异达显著水平(表 1)。1、3年生在8月龄时达到最大值，且分别比7月龄时增加37.98%和29.87%，以后一直呈不断下降的趋势；2年生随衰老的加深不断累积脯氨酸，并在9月龄时达到最大值，且分别比7月龄时增加17.55%。不同采穗母株年龄的脯氨酸平均含量按高低排列为：1年生＞2年生＞3年生，即采穗母株年龄越小，PRO含量越大。

2.8 3种插穗年龄的抗衰老特性综合比较

植物的抗逆性是由多方面的抗性相互作用的综合结果，根据单一指标评价植物的抗逆性往往带着片面性和盲目性。本试验参照木榄属(Bruguiera)、榆科(Ulmaceae)树种等植物的抗逆性分级评价法(咎启杰等，2002；韦小丽等，2005)对巨尾桉3种幼林的抗衰退生理生化指标进行综合评分，分值越高，抗衰退能力越强，总分见表 2。据表 2可知本试验的3种幼林抗衰退能力强弱分别为：1年生＞2年生＞3年生。

3 讨论

采穗圃是扦插繁殖成功的前提和基础，前人围绕如何提高扦插生根成活率为主要目标在促萌、插穗管理、采穗部位、插穗年龄、插穗贮藏等进行了大量研究(森下义郎，1988；谭健晖，2006)，不同的采穗母株年龄对扦插后代的影响以及影响的量化程度是个薄弱环节。笔者曾对巨尾桉不同插条年龄的扦插苗进行了1年的生长节律、形态学指标和抗病性(青枯病、焦枯病)观测，结果表明巨尾桉的树高、地径生长曲线均呈双峰型，峰值分别出现在3月和6月；不同插条年龄对巨尾桉扦插苗形态学指标的影响表现为，树高生长量1年扦插>2年扦插>3年扦插，地径生长量1年扦插>2年扦插>3年扦插；树干分枝角1年扦插>2年扦插>3年扦插；1 m内的分枝数3年生明显多于1年生；树干尖削度3年扦插>2年扦插>1年扦插；不同采穗年龄对扦插苗的生长及抗病性的影响表现为插穗年龄越大，扦插苗的生长及抗病性衰退越大(谭健晖等，2007)。Bolstad等(1982)以新西兰辐射松(Pinus radiata)为材料，对采穗母株进行修剪与不修剪2种处理，比较其扦插苗7年生时的生长表现，其结果表明来自修剪母株的扦插苗材积相对较大，但其树体疤多，侧枝大，尖削度大，树形明显不如来自未修剪者。2项研究的结果显示不同的插穗处理其扦插苗的生长及其形态学指标均有较大的差异。本试验是在前期研究的基础上从1年的叶片生理指标测定中选取巨尾桉双峰生长期为研究对象进行叶片抗氧化生理指标测定，旨在研究如何在同一环境条件下通过叶片抗氧化生理指标的测定，并结合巨尾桉形态学和生长指标，更准确、快捷地预测无性繁殖的衰退速度，以尽可能减少无性繁殖因人为干预而出现的遗传变异，确保巨尾桉无性系林业的整体水平。

叶绿素在植物光合作用中直接参与光能吸收和能量转化过程，是光合作用能否顺利进行的前提(王旭军等，2005)。本试验结果表明：同一采穗年龄扦插幼林的叶片叶绿素含量随着树龄的增加而不断下降，不同采穗年龄则表现为插条年龄越小，叶片叶绿素含量越大。以上2点证明，叶片叶绿素含量越低，说明光合作用能力越差，插穗年龄相对越大。

水溶性蛋白质含量是氮代谢的一个生理指标，包括大量参与各种生理代谢过程的酶类，它的含量与植物的生长密切相关(王旭军等，2005)。本试验表明：同一采穗年龄的扦插幼林的叶片可溶性蛋白含量随着树龄的增加不断下降，不同采穗年龄则表现为采穗年龄越小，其叶片的可溶性蛋白含量越大。因此，可溶性蛋白含量可作为巨尾桉采穗母株年龄的重要标志，可溶性蛋白含量越低，说明采穗母株年龄越大。

自由基导致植物衰老的学说近年来得到越来越多学者的认同，自由基学说认为衰老过程即为活性氧(reactive oxygen species，ROS)代谢失调而过量累积的过程(Choudhui, 1988; Harman, 1956; Woolhouse, 1980)，生长正常的植株体内活性氧的产生和消除处于动态平衡，平衡被破坏时，不同植物内源保护酶的活性和作用不同，因此抗衰老的能力也不同。SOD、POD、CAT是植物氧化代谢过程中的重要抗氧化酶类，具有维持活性氧代谢平衡、减少膜脂过氧化、稳定膜系统和保护膜结构的功能，是细胞内清除活性氧的保护酶(林植芳等，1984；王建华等，1989；李向东等，2001)。植物在衰老期间，叶片为保护自身免受ROS的伤害，具有激活内源保护系统(SOD、POD、CAT、AXT等)的能力，POD、SOD、CAT 3种保护酶协同作用，植物的抗逆性得以提高。本试验结果表明：同一种处理叶片的SOD活性总体上随着树龄的增加而不断下降，不同采穗年龄则表现为采穗母株年龄越小，其叶片的SOD活性越大，因此，SOD活性可以作为巨尾桉采穗母株年龄的重要标志，SOD的活性越强，表明采穗母株年龄越小，抗衰退能力越强；同一处理叶片POD活性随着树龄的增加呈现出先下降后上升的趋势，不同采穗年龄则表现为采穗母株年龄越小，其叶片的POD活性越大，因此，POD活性可以作为巨尾桉采穗母株年龄是否衰老的重要标志；同一处理叶片的CAT活性总体上随着树龄的增大而不断下降，2年生和3年生在9月龄时的CAT活性表现为先下降后升高的趋势，这是植物对衰老开始防御的反映，以此来减少衰老伤害，表明CAT在逆境的保护功能。这已在菜豆(Phaseolus vulgaris)、水稻(Oryza sativa)、花生(Arachis hypogaea)等植物叶片的衰老中被证实(Mcrae et al., 1983; 王旭军等，2005；戴良香等，2004)，但扦插苗叶片CAT活性与采穗母株年龄之间无明显的相关性，不宜用叶片CAT活性来判断采穗母株的年龄。

MAD、PRO被认为是膜脂过氧化反应的最终产物，其含量的高低反映了细胞膜脂过氧化的水平(李晓萍等，1988)。本试验表明：巨尾桉在衰退过程中膜脂过氧化不断加强，MAD含量不断增加，不同采穗年龄则表现为采穗母株年龄越小。其叶片的MAD含量越大，因此，MAD含量可以作为衡量巨尾桉采穗母株年龄的重要标志，MAD含量越高，表明采穗母株年龄越小，本试验处理9月龄时MAD含量有一个下降的过程，这主要是因为试验点在6月份出现了几次强降雨，明显地缓解旱情，高温高湿气候大大促进巨尾桉的生长，这一原因可能造成了MAD含量在8月龄至9月龄间有一个下降的过程，之后随着衰老的加剧，MAD迅速增加。PRO的含量变化可作为巨尾桉衰老的指标，随着树龄的延长，脯氨酸含量先升高后降低，说明巨尾桉叶片在不断积累脯氨酸以提高抗衰老的能力，这也是巨尾桉对衰老的一种保护性反应。不同采穗母株年龄则表现为采穗母株越小，其扦插苗叶片的PRO活性越大，因此，叶片PRO的含量可以作为采穗母株年龄的重要标志，PRO含量越大，采穗母株年龄越小。

植物的抗逆性是由多方面的抗性相互作用的综合结果，根据单一指标评价植物的成熟与衰退往往带着片面性和盲目性。本试验通过幼林叶片的抗氧化生理指标等对巨尾桉衰老进行综合评价，得出3种幼林的抗衰退能力强弱，1年生>2年生>3年生，建议生产上定期对扦插繁殖圃进行复壮更新，插穗年龄应严格控制在2年以内，以确保扦插繁殖苗木的可靠性和稳定性。

本试验通过巨尾桉幼树叶片的光合作用、氮代谢、内源保护酶系统以及膜脂反应产物等生理指标的动态变化研究看出，不同插条年龄的叶绿素含量、可溶蛋白质含量、SOD活性、POD活性、MAD含量、CAT活性和PRO含量等生理指标均达显著差异。叶绿素含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、MAD含量和PRO含量能稳定、准确地反映巨尾桉抗衰退的能力，以上6个指标与巨尾桉衰老具有明显的相关性。其中，叶绿素含量、可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性及PRO含量等5个指标与插穗年龄成负相关关系，以上指标数值越高，表明抗衰退的能力越弱；MAD含量与插条年龄成正相关关系，MAD含量越大，表明采穗母株年龄越大，扦插后代衰退越快；而CAT活性与采穗母株年龄的关系无规律性变化，不宜用CAT活性来确定采穗母株年龄。由于生理指标的变化常受环境条件等因素的影响，因此，判断子代衰退应在相同的环境条件下，以生理指标为主并结合巨尾桉形态学以及生长指标来确定插条年龄，进而确定巨尾桉子代的衰退速度。