文章信息
- 樊金会, 陈静, 李文卿, 李青, 邹琦.
- Fan Jinhui, Chen Jing, Li Wenqing, Li Qing, Zou Qi.
- 一个毛白杨MADS盒基因的克隆与功能分析
- Isolation and Functional Analysis of a MADS Box Gene in Populus tomentosa
- 林业科学, 2007, 43(4): 36-42.
- Scientia Silvae Sinicae, 2007, 43(4): 36-42.
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文章历史
- 收稿日期:2006-03-21
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作者相关文章
2. 山东农业大学生命科学学院 泰安 271018;
3. 中国农业大学生物学院 北京 100094
2. College of Life Science, Shandong Agricultural University Tai'an 271018;
3. College of Biological Science, China Agricultural University Beijing 100094
高等植物花发育相关分子机制的研究一直是人们感兴趣的问题,Coen等(1991)在对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、矮牵牛(Petunia hybrida)和金鱼草(Antirrhinum majus)突变体及其基因功能分析的基础上,提出了花器官发育的ABC模型。经过逐步完善,ABC模型已发展为ABCDE模型(Theissen, 2001)。目前,这一模型作为解释花器官发育的基本分子机制,已得到广泛认可。
当矮牵牛FLORAL BINDING PROTEIN 7(FBP7)基因和FBP11基因组成性表达时,转基因植株花的花被器官上形成异域的胚珠,因此,它们被认为是控制胚珠发育的主要基因(Colombo et al., 1995)。在拟南芥中,与FBP7和FBP11功能相似的基因为SEEDSTICK(STK/AGL11)、SHATTERPROOF1(SHP1/AGL1)和SHP2(AGL5)(Favaro et al., 2003)。这样,将胚珠看作花器官的第5轮,把上述基因视为D类基因,从而产生了ABCD模型(Colombo et al., 1995)。
最早发现的E类基因是矮牵牛的FBP2,该基因反义转化和共抑制植株表现为内3轮花器官均被花萼所替代,并且失去了花的有限性(Angenent et al., 1992)。随后在矮牵牛中又发现了FBP5和FBP9,其反义转化和共抑制表型均与FBP2类似(Angenent et al., 1992;1994;Mandel et al., 1998;Flanagan et al., 1998;Immink et al., 2002)。在拟南芥中,AGL2、AGL4和AGL9分别是FBP2、FBP5和FBP9的同源基因,agl2、agl4、agl9三个基因同时突变的突变体也表现为内3轮花器官转变为花萼,但3个基因中任何1个或任何2个发生突变,对花器官的特异性均无明显影响(Pelaz et al., 2000)。AGL9、AGL4、AGL2分别被重命名为SEP1、SEP2和SEP3, 认为它们是花瓣、雄蕊和心皮内3轮花器官发育所必需的新一类的花器官特征基因。于是,把SEP类基因确定为E类基因,ABCD模型也修改为ABCDE模型(Pelaz et al., 2000;Theissen, 2001)。
在拟南芥中,过量表达AP3-PI-SEP3、AP1-PI-SEP3或AP1-AP3-PI-SEP3,叶转变成花瓣;过量表达PI-AP3-SEP3-AG,叶转变成雄蕊;过量表达SEP3-AG,叶转变为心皮(Honma et al., 2001),说明SEP类与A类、B类和C类基因共同作用可以将叶转变为花器官。
杨属(Populus)是木本植物生物学研究的重要模式植物。随着对毛果杨(P. trichocarpa)全基因组测序的完成,对它的分子水平的研究引起世界范围内的关注。由于杨属植物为单性无被花,其花结构不同于拟南芥、金鱼草等植物的花结构,因此,用ABC模型来解释杨属植物花器官的发育显然存在困难。
本文以毛白杨(P. tomentosa)为材料,分离出了一类似拟南芥SEP类的基因PtSEP3(Populus tomentosa SEP3 like),此基因对毛白杨进行遗传转化显示它控制心皮发生,也影响叶的发生和形态。对PtSEP3基因的序列的比较、转基因植株表型的分析和表达模式的分析,可以有助于理解杨树单性无被花发育的机制。
1 材料与方法 1.1 植物材料与培养试验所用植物材料主要取自毛白杨‘易县雌株’(P. tomentosa cv. ‘hopeinica’)。该品种为雌性,具有开花结实早的特点。在表达分析中,所用幼茎、茎尖、幼叶和雌蕊材料取自此品种10年生的同一开花期植株,而根则取自此品种通过组培繁殖的大田栽植苗,为白色新根(下称幼根)。在表达分析中所用雄蕊取自其他普通毛白杨植株。
野生型和转基因型毛白杨的组织培养主要参考了崔等(1985)的方法。以MS为基本培养基(3%蔗糖, 0.8%琼脂, pH 5.6),附加0.25 mg·L-1 6-BA,0.25 mg·L-1 ZT和0.25 mg·L-1 IAA作为叶圆盘的芽分化培养基;附加10 mg·L-1 VB1和0.25 mg·L-1 IBA作为芽生根培养基。遗传转化所用的外植体取自维持在生根培养基上的无菌苗,而后取转基因毛白杨无菌苗的1 cm长根段作为外植体,在芽分化培养基上培养观察其分化变化。
组织培养条件为:温度(25±1) ℃;光/暗培养为16 h/8 h;光照强度为2 000 lx。
1.2 PtSEP3基因的分离与序列分析以从毛白杨入冬后的休眠花芽剥离的幼花序为材料,利用TRIZOL试剂盒提取不同材料的总RNA,取2 μg进行反转录,合成cDNA的第一条链,所用反转录酶为M-MLV(TaKaRa)。以反转录产物为模板,用PCR技术分离基因。首先根据保守的蛋白序列IENKIN和QKCNYG设计一对兼并引物,SEP3-1和SEP5-1,获得保守的中间片段。再根据中间片段的测序结果,设计特异引物SEP3-R,结合Oligo-dT通用引物B26,通过3′RACE PCR分离基因的3′端片段。用TdT对反转录产物的cDNA,在5′端加多聚dCTP,再设计特异引物SEP5-R,利用通用引物AAP,进行5′RACE PCR,获得基因的5′端片段。对基因两端片段进行测序,获得基因的全序列。最后,在基因两端,设计特异引物SEP-P和SEP-R,分别附加有BamHⅠ和SacⅠ限制性内切酶酶切位点,分离含读码框的近乎全长(1 ~ 1 058 bp),进行测序验证。PCR循环参数为:94 ℃变性1 min,56 ℃ 1 min,72 ℃延伸1.5 min,运行35个循环。
基因分离过程所用的克隆载体为pGEM-T Easy vector(Promega),大肠杆菌转化的受体菌株为DH5α。
本试验所用引物:
SEP3-1:5′-AT(A/T/G)GA(A/G)AG(T/C)AA(A/G)AT(A/T/C)AA-3′;
SEP5-1:5′-CA(A/G)AA(A/G)TG(C/T)AA(T/C)TA(T/C)GG-3′;
SEP3-R:5′-GAAGAAAGCCTATGAGC-3′;
SEP5-R:5′-TACAGCTTTCCTCTATT-3′;
SEP-P:5′-AAGGATCCATTCGCGAGAGCCATGG-3′ (BamHⅠ);
SEP-R:5′-AAGAGCTCGCTGGAGTATCTTATGGT-3′(sacⅠ);
B26:5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTT-3′;
AAP:5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′;
UBIF:5′-CAAACCCTCCTCCTCCTCC-3′;
UBIR:5′-TTCACGAACTCTGCGATTG-3′。
用NCBI BLAST和DNAman 4.0软件进行基因有关的序列分析。
1.3 毛白杨的遗传转化根据质粒载体和外源基因所携带的酶切位点(BamHⅠ和SacⅠ),将经限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ酶切后的片段插入载体pBI121,载体构建过程见图 1。
用冻融法将表达载体转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101,转化毛白杨。毛白杨遗传转化采用王善平等(1990)的叶圆盘方法。叶圆盘在芽分化培养基上预培养2 d后,再与5×108 cell·mL-1浓度的农杆菌菌液共培养2 d,接种于附加50 mg·L-1卡那霉素(Km)和500 mg·L-1头胞塞亏那(Cef)的筛选培养基上,获得抗性芽。然后将抗性芽转至MS附加50 mg·L-1 Km和500 mg·L-1 Cef的生根培养基上,获得抗性植株。组织培养条件同在1.1中所述。
遗传转化植株和野生型对照植株用拟南芥培养介质(营养土、蛭石和沙按1:1:1的体积混合)盆栽,定期浸1/8 MS培养基矿质液体。栽培温室环境:温度18 ~ 28 ℃,光照强度至少2 000 lx,光期/暗期为16 h/8 h。
1.4 基因表达的RT-PCR分析以毛白杨植株的叶片、幼茎、幼根、雌蕊和雄蕊,以及转基因系再生芽体在生根培养基上所发生的根为材料提取总RNA。取1 μg的总RNA用20 μL的MLM-V(TaKaRa)酶反应体系反转录合成cDNA的第一条链。在加入反转录酶前,先加入1 μL不含RAN酶的DNase A(1 unit·μL-1,Invitrogen),在37 ℃反应30 min,去除基因组DNA。采用目的基因特异引物SEP-P和SEP-R进行PCR扩增。以泛素载体蛋白基因UBI(AY660750)序列设计引物UBIF/UBIR,RT-PCR扩增产物作为总RNA模板定量的内标。RT-PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min;循环参数为94 ℃变性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,运行30个循环后,72 ℃延伸10 min,而UBIQUITIN的PCR反应为25个循环。PCR产物电泳用溴化乙锭显色。UBIQUITIN的扩增产物连接于pGEM-T Easy vector进行测序验证。
1.5 切片制作所显示切片为常规石蜡切片。培养的子房状结构材料固定于FAA中。固定后的材料经脱水、透明、透蜡、包埋后进行切片。切片厚度为10 ~ 12 μm,切片后进行脱蜡、复水,再用番红-固绿对染。经再脱水、透明等处理,最后以加拿大树胶封固。封片后用OLYMPUS BH-2型显微镜观察,拍照。
2 结果与分析 2.1 PtSEP3基因序列的分析用以上方法获得了长度为1 107 bp的cDNA,命名为PtSEP3,并在GenBank中登记(序列号为DQ445094)。该基因具有一个729 bp的完整的读码框,用NCBI BLAST工具推测出的蛋白序列显示PtSEP3为一MADS盒基因。PtSEP3所编码的蛋白含有243个氨基酸残基。由于PtSEP3氨基酸序列与拟南芥MADS盒基因AGL6/SEP分支同源性最高,把PtSEP3蛋白与拟南芥AGL6/SEP分支的MADS盒蛋白比较(图 2),结果显示PtSEP3与这一分支的蛋白序列高度同源,其中与SEP3相同性最高,同源性为76%。它们的蛋白序列在MADS盒区(1 ~ 56氨基酸残基)同源性高达95%,而在其他区段保守性较差。
用DNAman 4.0软件对PtSEP3与拟南芥AGL6/SEP分支的MADS盒基因的氨基酸序列进行同源分析(图 3),所产生的同源树显示,在蛋白水平上PtSEP3与SEP3最为相似。因此,从序列上,初步可以判断PtSEP3为SEP3的同源基因。
在35S启动子的驱动下,用叶圆盘法转化PtSEP3,获得了毛白杨的转基因植株。温室条件下栽培的1年生转基因植株生长正常,没有开花。在形态上出现显著变化,一是叶序变得十分混乱,常常3 ~ 4枚叶片集生于同一节,同时存在一节部着生1枚叶片(图版Ⅰ-1);二是转基因植株的大部分叶片的叶基为楔形(图版Ⅰ-4)。在同一植株上,同时也生长心形叶基的叶片,可能是转基因植株为嵌合体的缘故。野生型植株的叶为心形叶基,互生叶序(图版Ⅰ-2,5)。由于PtSEP3在地上部分的营养器官中表达,因此,初步认为在茎顶端分生组织中,PtSEP3在决定叶原基发生和叶片形态方面起着重要作用。这在对拟南芥的相关研究中是没有出现的现象。
PCR检测结果表明,抗性植株为超表达PtSEP3转基因植株。在筛选培养基上,叶外植体可以产生抗性芽,同时也可以直接产生子房状结构。转基因芽或转基因植株(无菌苗)的叶外植体在芽分化培养基上,能够分化出大量的子房状结构体,具有1~2枚明显的柱头状结构。这些子房结构的外部形态与野生型的子房相似,但没有花苞片和花盘的形态结构(图版Ⅰ-2,6,6,8)。野生型叶外植体只能够产生营养芽。PtSEP3转基因植株的根在分化培养基上,也可以分化出子房状结构体(图版Ⅰ-9),而野生型根外植体在芽分化培养基上,在3个月试验期内不能够进行器官的分化。子房状结构的石蜡切片显示在其中下部有一团排列紧密、体积小、内含物丰富的细胞组成的卵形子房室状轮廓,相对应外围细胞则排列较松散、体积较大、内含物较少(图版Ⅰ-7)。没有观察到其他子房形态特征结构,如胚珠。由此,在离体条件下35S∷PtSEP3诱发了子房结构。
2.4 PtSEP3的表达模式PtSEP3在毛白杨花器官和营养器官均可表达。RT-PCR分析结果(图 4)显示,像预期的一样,PtSEP3在雌蕊和雄蕊中表达,在开花植株的营养器官的幼叶和幼茎中,以及顶芽中也表达,但在根中未能检测到其表达。PtSEP3的mRNA则出现在抗性植株的根中,说明抗性植株为有PtSEP3 mRNA转录的转化植株。因此,根据拟南芥SEP3的功能特点,PtSEP3在花器官中起着重要作用。在叶的发育中可能也具有其功能,或者由于PtSEP3的过量表达干扰了叶片的发育和叶片形态。
木本植物生命周期长,研究其花器官发育有很大的困难,杨属植物作为木本植物生物学研究的模式植物,也不例外,研究资料较少。与花器官发育研究的模式植物比较,杨属的单性无被花具有其特殊的结构特点,开展对其花器官形成的研究有很大意义。为了解MADS盒基因在杨树花器官发育中的功能,因此分离出PtSEP3,从基因的蛋白序列比较结果上可以判断其与拟南芥SEP类基因同源。由于拟南芥SEP类基因属于MADS盒基因家族,其进一步的归类主要是基于C区的序列特征和它们的功能(Litta et al., 2003)。PtSEP3与拟南芥SEP类基因的蛋白序列之间存在一定的差异,反映出在不同的植物种类中,SEP类基因的分化,可能它们的功能也存在着差异。
从功能上来看,毛白杨PtSEP3基因与拟南芥SEP类至少是二者都在心皮发育中起作用。根据ABCDE模型,拟南芥雌蕊发育是由C类和E类基因共同决定的,单独的C类基因AG超表达出现花萼转化为心皮结构,花瓣转化为雄蕊状结构(Mizukami et al., 1992)。在拟南芥中,单独过量表达SEP类基因出现植株开花提前,而花结构没有发生变化(Tzeng et al., 2003);SEP3与AG同时超表达植株,叶转变为心皮(Honma et al., 2001),由于SEP类基因在四轮花器官原基和花分生组织中均有表达,因此,它们既为花器官特征基因,又在花分生组织特性决定中起作用。PtSEP3转基因型在调控花器官的发育方面所展示的功能与拟南芥SEP类功能是一致的。其一,超表达PtSEP3使得本应该分化为芽的营养顶端分生组织可能具有了心皮原基的性质,而形成了子房。在拟南芥花器官发育决定中,有关的MADS盒蛋白是通过同源或异源聚合体来决定花器官分生组织特性的(Honma et al., 2001;Favaro et al., 2003;Fan et al., 1997)。心皮原基则是由具有E类基因功能的SEP类和具有C类基因功能的AG类共同决定的。毛白杨离体发生的子房可能也需要有AG类相应功能的基因的参与。在拟南芥中,最新的研究证明,SEP类可以激活AG类基因的表达(Castillejo et al., 2005),在毛白杨中也可能存在这样的机制。在毛果杨中,AG有2个成员PTAG1和PTAG2,在营养器官中具有一定水平的表达(Brunner et al., 2000)。因此,PtSEP3可能与毛白杨的AG类基因共同作用,在离体条件下促进子房的形成。其二,由于杨树的花为单性无被花,对于雌花来说,一个雌蕊也可能是一朵完整的雌花。转基因型形成的子房状结构应当是由营养顶端转化而来的,似乎是PtSEP3在顶端分生组织的特性决定中起着关键作用。以上的2种情况可能同时存在。
在温室条件下生长的1年生PtSEP3的转基因毛白杨植株没有开花。SEP3超表达植株在发生1 ~ 3枚真叶后即开花,在调节开花时间方面与拟南芥有所不同。许多研究都说明在不同种类中的SEP类同源基因具有不同的功能。例如,非洲菊(Gerbera hybrida)的一个SEP类同源基因GRCD1,反义表达的转基因植株的雌花的不育雄蕊转化成了花瓣(Kotilainen et al., 2000)。水稻(Oryza sativa)的3个SEP类基因OsMADS5、OsMADS7和OsMADS8控制开花时间(Kang et al., 1997a;1997b)。抑制番茄(Lycopersicon esculentum)的SEP3同源基因TM5的表达的转基因植株,每轮花器官数目都发生了变化,并且增加了一轮花器官;花瓣绿色,雄蕊和雌蕊不育(Pneuli et al., 1994)。PtSEP3与拟南芥SEP3在表达的时空模式和功能上也存在差异,再加上杨树与拟南芥的花结构差距很大,因此,用ABC模型来解释杨树花器官发育还需更多的试验证据。
叶片起源于茎顶端分生组织。近年的研究结果显示叶片发生的数量是由生长素诱导的,叶序也是由生长素在茎顶端分生组织的不同细胞之间的运输决定的。在MADS盒基因家族内,影响叶片发生的因子还很少报道,一拟南芥MADS盒基因KN1通过促进细胞分裂素的合成影响叶片形态(Lincoln et al., 1994;Rupp et al., 1999)。从毛白杨PtSEP3转基因植株的叶片形态和叶序所发生的变化来看,PtSEP3不但在开花器官分生组织或花分生组织中起作用,在营养顶端特性保持中可能也起一定的作用,并进一步影响叶片的形态。
在基因表达上,PtSEP3在雌蕊和雄蕊中表达,也在除了根以外的营养器官中表达,还在营养芽中表达。拟南芥SEP类基因在花分生组织中表达,在四轮花器官以及胚珠中均表达,但在营养器官不表达,结合其在拟南芥花发育中的功能,认为它们均为花器官特异基因,并确定花原基的有限性。PtSEP3的表达模式与拟南芥SEP类明显不同。在美洲山杨(P. tremuloides)中,存在PTM3、PTM4和PTM6三个SEP类的同源基因,其中的PTM3和PTM4除了在花分生组织和花器官表达外,也在芽、幼叶和幼茎中表达(Cseke et al., 2005),这与PtSEP3的表达模式是一致的。
根据PtSEP3基因的序列、转基因表型和表达模式,以及与拟南芥SEP类的比较,可以初步得出,毛白杨PtSEP3在花分生组织中控制花器官的特性,在营养顶端分生组织中起作用从而影响叶片的形态发生。
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