同源多倍体是遗传学和育种学研究中的重要中间材料, 既可被用作亲本提高远缘物种间杂交成功的机率，又可通过与原二倍体杂交、回交，在其后代中筛选出各种非整倍体，从而为该物种的基因定位、连锁群分析和分子标记等研究奠定基础(常金华等，2002；程祝宽等，1996；Khush et al., 1984)。目前，国内外已有多种四倍体植物培育成功，并在生产中产生了显著的经济和社会效益(常金华等，2002；韩礼星等，1998；孔凡功等，2004；蒋洪恩等，2004；刘庆忠等，2001；罗耀武等，1997；王树芝等，2002；杨今后，2004；张文杰等，2004；Chakraborti et al., 1998；Cohen et al., 1996；Kadota et al., 2002；Kheiria et al., 2006；Pinheiro et al., 2000; Roy et al., 2001), 而有关多倍体林木品种培育的研究则相对较少(康向阳等，2000；2004；李云等，2000；2001；杨今后，2004；平吉功，1950)。泡桐(Paulownia)为玄参科(Scrophulariaceae)落叶乔木，是我国重要的速生优质用材和绿化树种。近年来，有众多学者对其进行了研究(范国强等，2002；2005；2006；翟晓巧等，2004；Bergmann et al., 1997；Fan et al., 2002；Kalaycioglu et al., 2005；Ipekci et al., 2003；Rao et al., 1996), 但目前国内外只有毛泡桐(P.tomentosa)种和兰考泡桐(P.elongata)多倍体研究的报道(平吉功, 1950)。为了扩大泡桐种质资源的遗传背景，深入开展泡桐基因工程和细胞工程研究，从而培育出满足人们要求的泡桐新品种，本文用不同浓度秋水仙素处理白花泡桐(P. fortunei)叶片，研究其同源四倍体的诱导技术。

1 材料与方法 1.1 试验材料及处理

将2004年9月20日采集的白花泡桐种子用70%的酒精消毒30 s后，再用0.1%的HgCl₂消毒5 min，然后用无菌水冲洗5次，用灭菌吸水纸吸干种子表面液体后放置到不含植物激素的PC培养基上，在培养箱内[温度(25±2) ℃，光照强度130 μmol·m^-2 s^-1，光照时间16h·d^-1]培养。将生长80 d的同一株白花泡桐组培苗顶部2片完全展开叶片放在其器官直接发生的培养基(翟晓巧等，2004)上增殖后，取其叶片待用。

1.2 试验方法 1.2.1 试验设计

秋水仙素处理白花泡桐无菌苗叶片试验采用L₉(3³)正交设计(袁志发等，2000)。秋水仙素浓度、外植体预培养时间和秋水仙素处理时间分别为5、10、20 mg·L^-1，0、6、12 d和24、48和72 h(表 1)。

1.2.2 试验方法及数据处理

将培养40 d白花泡桐无菌苗顶端伸展的2对叶片剪成0.5 cm×1.0 cm的小块(外植体)，分别接种于盛有40 mL MS + NAA 0.1 mg·L^-1+ BA 18 mg·L^-1(翟晓巧等，2004)的100 mL的三角瓶中，预培养0、6和12 d后，放在秋水仙素浓度分别为5、10和20 mg·L^-1的双层培养基(上层为10 mL不加琼脂粉的MS + NAA 0.1 mg·L^-1+BA 18 mg·L^-1液体培养基，下层为上面铺2层滤纸的30 mL MS + NAA 0.1 mg·L^-1+ BA 18 mg·L^-1固体培养基，上、下层培养基中秋水仙素浓度相同)上，然后，在温度为20 ℃的黑暗条件下处理24、48和72 h。处理结束后，先用无菌水清洗外植体3次，再用无菌滤纸吸干外植体表面液体后转到不含秋水仙素的上述固体培养基上，于温度为(25±2) ℃、光照强度130 μmol·m^-2 s^-1、光照时间16 h·d^-1的培养室内培养。每处理60个外植体。40 d时统计外植体存活率(存活外植体数/放置外植体总数)及芽诱导率(诱导出芽的外植体个数/放置外植体总数)，选取长约2 cm的幼芽转入1/2MS+NAA 0.1 mg·L^-1中诱导其生根，20 d后剪其顶芽2 cm长放到生根培养基中继代培养。每20 d继代1次，共继代5次。第5次继代苗培养20 d时，先剪其根尖制临时压片用于染色体倍性观察，再用流式细胞仪确认染色体数变化的白花泡桐幼苗的倍性，并计算四倍体诱导率(用细胞DNA含量确认诱导出四倍体的外植体数/放置外植体总数)。每组试验重复2次，数据采用SPSS软件处理，并进行F检验。

1.2.3 植株倍性鉴定

1) 染色体计数  二倍体和诱导变异白花泡桐幼苗根尖细胞染色体观察参见舒寿兰(1985)法。将制成的白花泡桐根尖临时压片放于尼康TS-100荧光倒置显微镜(×2 000)下，观察其染色体条数并拍照。2)叶片单细胞相对DNA含量测定  分别将约20 mg的二倍体和染色体变化的白花泡桐叶片在1 mL缓冲液Ⅰ(0.1 mol·L^-1柠檬酸和0.5% Tween)中用锋利的刀片或剪刀快速将其切碎，用30 μm尼龙网过滤至1.5 mL离心管中, 150 g室温离心3 min，弃去上清液，加入100 μL新鲜的缓冲液Ⅰ，轻微振荡摇匀后，再加入500 μL缓冲液Ⅱ(0.4 mol·L^-1 Na₂HPO₄·12H₂O +4 μg·mL^-1 4, 6-二氨基-2-苯基吲哚+ 50 μg·mL^-1 RNase)，轻微振荡, 混匀10 min后，加入仪器所带荧光染色液。染色后上样于Calibur流式细胞仪测定单细胞DNA相对含量，并用连接的电脑软件自动分析测定结果，打印出DNA相对含量分布图。

1.2.4 植株形态变化

观察比较上面生长40 d第5次继代的二倍体和四倍体白花泡桐幼苗叶片大小、叶色、整株生长等差异，并记录叶片的长和宽。每一指标测定10个样品，求其平均值。

1.2.5 叶片气孔器大小和密度测定

取苗龄60 d的二倍体和四倍体白花泡桐组培苗成熟叶片，在5% KOH溶液中煮沸3~5 min，然后置于冷水中，先在载玻片上加1滴清水，用镊子小心挑取其表皮置于载玻片的水滴上，小心用镊子和毛笔将其展开，吸去多余的水，加1滴I₂-KI溶液，染色1 min，加盖玻片后用装有测微尺镜头的显微镜观察。每个压片至少观察10个视野，观察记录每个视野内单个气孔器的长度、宽度和气孔器个数。重复3次，取平均值。

2 结果与分析 2.1 秋水仙素处理对白花泡桐叶片四倍体诱导的影响

秋水仙素作为生物细胞分裂中期纺锤丝形成的抑制剂，其浓度和处理时间与白花泡桐叶片存活率、芽诱导率和四倍体诱导率密切相关(表 1)。当秋水仙素浓度为5 mg·L^-1时，随着外植体预培养时间和秋水仙素处理时间的变化，外植体存活率、芽诱导率和四倍体诱导率表现出较大的差异。其中，第3试验组合的外植体存活率、芽诱导率和四倍体诱导率分别高达41.7%、25.0%和20.0%。当秋水仙素浓度为10 mg·L^-1时，第4试验组合的外植体存活率、芽诱导率和四倍体诱导率达到最大。当秋水仙素浓度为20 mg·L^-1时，第9试验组合的外植体存活率和四倍体诱导率达到最大。这些结果表明：随着秋水仙素浓度的增大，不同预培养时间的白花泡桐叶片的最大存活率、芽诱导率和四倍体诱导率逐渐下降，并且秋水仙素浓度对外植体存活率和芽诱导率影响表现出极显著差异，而对四倍体诱导率影响则差异不显著；秋水仙素处理外植体的时间和外植体的预培养时间对芽诱导率和四倍体诱导率的影响分别达到显著和极显著差异(表 2)。也就是说，白花泡桐最高四倍体诱导率的产生是秋水仙素浓度、处理时间和外植体预培养时间共同作用的结果。因此，选择组合3作为诱导白花泡桐四倍体的最佳方案。

2.2 植株形态变化

观察生长40 d第5次继代的四倍体和二倍体植株后发现，四倍体白花泡桐幼苗比对照(二倍体)幼苗生长健壮(图版Ⅰ-1, 2)，幼苗叶片增大、增厚(图版Ⅰ-3, 4)。二倍体叶片长宽比大于四倍体叶片(图版Ⅰ-3, 4；表 3)。四倍体植株叶片气孔器长、宽均大于二倍体叶片，但四倍体气孔密度较小(图版Ⅰ-5, 6；表 3)。

2.3 变异植株的倍性鉴定 2.3.1 变异植株染色体观察

将秋水仙素处理后再生的变异植株白花泡桐组培苗根尖制成临时压片，在尼康TS-100荧光倒置显微镜下观察发现，诱变的白花泡桐幼苗根尖细胞染色体条数为2n=4x=80，正常二倍体白花泡桐组培苗根尖细胞染色体为2n=2x=40(图版Ⅰ-7, 8)。染色体观察结果表明，在发生诱变的白花泡桐植株细胞中，染色体数均为正常二倍体的2倍。

2.3.2 变异植株叶片单细胞DNA含量测定

由秋水仙素处理后继代5次的染色体变异植株和二倍体植株叶片单细胞DNA含量分布图(图 1)可以看出，二倍体对照植株仅在相对荧光强度值为50的位置上出现1个单峰，变异植株在接近100的位置上出现1个单峰，在50和100位置以外未出现明显的其他峰，即变异植株叶片单细胞DNA含量为二倍体叶片的2倍。因此，可以得出，秋水仙素处理后获得的变异植株均为四倍体植株，没有嵌合体和八倍体植株的产生。

3 讨论

目前，利用秋水仙素成功诱导出多倍体植物的种类很多，但是诱导不同植物的最适材料存在一定的差异。罗耀武等(1995; 1997)和陈俊等(1995)分别用玫瑰香和瑰宝葡萄(Vitis)种子为材料均获得了四倍体植株，但是后期出现了四倍体不稳定的现象。张淑爱等(1989)和卢炳芝等(1997)分别用秋水仙素处理葡萄试管苗茎段和体细胞胚状体也获得了四倍体，但是所获得的结果以嵌合体占大多数。出现该结果的原因可能与所用试验材料的种类有关。当试验材料为植物种子时，只有当秋水仙素与植物种子胚芽原基中特定1~3层处于分裂中期细胞完全作用，全部加倍的染色体才能形成同源四倍体植株，如果秋水仙素作用的这些细胞染色体不能全部加倍，结果就会导致嵌合体或非整倍体的出现。当试验材料为植物茎段或体细胞胚状体时，由于外植体细胞所处分裂状态和时期存在一定的差异，秋水仙素处理外植体后形成植株的细胞就会出现杂合状态，造成大量嵌合体植株的出现(李云等，2001；孙日彦等，1997)。在本试验中，以预培养白花泡桐叶片为材料进行秋水仙素处理，获得的诱变植株大部分为四倍体，并且这些四倍体能够稳定地遗传，其原因可能是用5 mg·L^-1秋水仙素处理预培养12 d的白花泡桐叶片72 h时，由于叶片较薄，细胞分裂旺盛、分裂的同步性好，此时秋水仙素易抑制纺锤丝的形成，从而导致大量的细胞染色体加倍，这样, 获得变异植株中出现嵌合体的机率就小。即使试验中有嵌合体或非整倍体植株存在，经过5次继代植株倍性也恢复到原二倍体状态(李云等，2001)。因此，在诱导的变异植株中检测不到嵌合体和非整倍体植株的存在。此外，未发生嵌合体可能还与材料的基因型、生理状态、材料的形态学位置及预培养对秋水仙素的敏感程度等因素有关。