Wolbachia是一类以节肢动物及线虫为宿主的细胞质共生细菌，属于Proteobacteria的α亚门。其传播方式主要为垂直传播，即母代感染的细菌经卵细胞的细胞质传播至子代(Stouthamer et al., 1999)。Wolbachia能对被感染昆虫等节肢动物的生殖方式进行调控，如引起宿主胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility)、诱导孤雌生殖(parthenogenesis-inducing)、雌性化(feminizing)及雄性致死(male-killing)(Werren, 1997; Stouthamer et al., 1999)。根据近年的研究，感染Wolbachia的昆虫种类估计超过17%(Werren et al., 1995; 2000；West et al., 1998)，一些学者甚至推测感染昆虫的种类可能达到76%(Jeyaprakash et al., 2000)。Wolbachia有可能是自然界分布最广、丰度最大的共生菌。在膜翅目昆虫中，许多寄生蜂种类的产雌孤雌生殖(thelytoky)被证实与Wolbachia的共生有关(Stouthamer et al., 1993; Chen et al., 1992；Arakaki et al., 2001; Huigens et al., 2004)，还发现Wolbachia能引起一些种类寄生蜂的胞质不亲和(Breeuwer et al, 1993; Perrot-Minnot et al., 1996; Vavre et al., 2000)。

瘿蜂科昆虫主要危害壳斗科植物，亦有一些种类危害蔷薇科、菊科等，一般于危害部位形成虫瘿。瘿蜂科可划分为6个族，即Aylacini族(危害草本植物)、Eschatocerini族[危害金合欢属(Acacia)和牧豆树属(Prosopis)植物]、Diplolepidini族[危害蔷薇属(Rosa)植物]、Synergini族(本身不形成虫瘿，寄居于其他瘿蜂形成的虫瘿内)、Pediaspidili族[危害槭属(Acer)植物]及Cynipini族[危害栎(Quercus)属、栗属(Castanea)及其近缘属](Lijeblad et al., 1998; Ronquist, 1999)。Aylacini族、Eschatocerini族、Diplolepidini族和Synergini族主要进行产雄孤雌生殖(arrhenotoky)(孤雌生殖中所产生的后代都是雄性的生殖方式)，在Aylacini族和Diplolepidini族中亦有一些种类进行产雌孤雌生殖(Askew, 1984; Plantard et al., 1998；1999)。Pediaspidili族和Cynipini族进行周期性的孤雌生殖，即孤雌生殖与两性生殖周期性发生的生殖方式(Askew, 1984; Atkinson et al., 2002; Stone et al., 2002)。Cynipini族种类最多，已知有44属974种，多数种类进行周期性孤雌生殖，但也有一些种类营产雌孤雌生殖(Lijeblad et al., 1998; Ronquist, 1999)。这些种类的产雌孤雌生殖，很有可能与Wolbachia的共生有关，因Wolbachia的影响导致产雄孤雌生殖世代的缺失(Abe, 1986; Stone et al., 2002)。

栗瘿蜂(Dryocosmus kuriphilus属瘿蜂科Cynipini族，主要危害板栗(C. mollissima)，也危害茅栗(C. sequinii)和锥栗(C. henryi)。受害芽春季形成瘤状虫瘿。国内分布于陕西、河北、山东、河南、湖北、湖南、福建等省，国外分布于日本、朝鲜。1年发生1代，营孤雌生殖(靳杏蕊等，1995；吴晖等，2004；丁玉洲等，2004)。本文通过PCR法对栗瘿蜂的株洲种群共生Wolbachia进行了检测, 并对其wsp基因序列进行了测定，通过与已知瘿蜂科中其他种类Wolbachia的wsp基因序列对比, 确定了株洲种群栗瘿蜂共生Wolbachia的进化位置，为进一步探讨Wolbachia对其孤雌生殖的诱导提供了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

栗瘿蜂的虫瘿于2004年5月采自湖南省株洲市中南林业科技大学株洲校区标本园，采集的带虫瘿的板栗枝条基部以吸水的脱脂棉包被置于(25±1) ℃的人工气候室内(宁波江南仪器设备厂)，羽化成虫以无水乙醇浸泡，于-20 ℃的冷冻柜保存备用。

1.2 总DNA的提取

每次进行DNA提取时，以超纯水洗涤后的栗瘿蜂成虫1个体置于装有50 μL STE缓冲液(100 mmol·L^-1 NaCl, 10 mmol·L^-1 Tris-HCl, 1 mmol·L^-1 EDTA, pH 8.0)的1.5 mL离心管内, 将其充分捣碎。加SDS至终浓度为1%，加蛋白质分解酶K(20 mg·mL^-1), 37 ℃水浴加温30 min。加等量的PCL (苯酚:氯仿:异戊醇= 25:24:1)抽提，5 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，再加等量PCL抽提，5 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，然后，加1/10体积3 mol·L^-1醋酸钠，加2.5倍体积无水乙醇-20 ℃过夜，经低温离心，去上清液，用75%冷乙醇洗涤, 低温离心去上清液、干燥后, 获纯净DNA。加TE缓冲液溶解DNA备用。

1.3 Wolbachia的wsp基因片段的PCR扩增

使用的wsp基因特异性引物为wsp81F(5′-TGGTCCAATAAGT GATGAAGAAAC-3′)和wsp 691R(5′-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3′。PCR扩增体积为25 μL, 包括2 μL模板DNA, 17.1 μL H₂O, 2.5 μL 10×buffer, 1 μL dNTPs (10 mmol·L^-1), 上游和下游引物(10 μmol·L^-1)各1 μL以及0.4 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL^-1)。PCR扩增循环是: 95 ℃预变性3 min, 95 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共35个循环, 循环结束后72 ℃处理7 min。

PCR扩增产物用1.0 %的琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中电泳, 电压70 V, 电泳时间约1 h。电泳后以溴化乙锭染色, 凝胶成像系统检测并摄影。DNA分子质量采用Fermentas公司的DNA MW Maker标记。以水为阴性对照。

1.4 Wolbachia的wsp基因片段序列测定与分析

采用克隆测序方法，回收后的PCR产物与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，再转化到感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆, 随机挑选3个克隆产物由上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，以它们的一致序列为准。DNA序列检索和同源性比较利用BLAST工具(NCBI)。利用Clustal X软件对所测得的Wolbachia的wsp基因序列以及GenBank中已知的其他瘿蜂Wolbachia的wsp基因序列进行序列完全排列，用支序系统学PHYLIP 3.6a软件包进行1 000次的自导复制(bootstrap replication), 用DNADIST程序根据Kimura's 2-parameter模型计算遗传距离, 在NEIGHBOR程序中用邻位相连法(neighbour-joining analysis)获得聚类图, 最后在CONSENSE程序中形成系统进化树。

2 结果与分析 2.1 栗瘿蜂共生Wolbachia的PCR检测

利用Wolbachia的wsp基因的一对通用引物(81F, 691R)，成功地从栗瘿蜂总DNA中扩增到一条600 bp左右的wsp基因片段(图 1), 证实了Wolbachia在我国栗瘿蜂体内的感染。采用克隆测序方法，对该基因片段进行了序列测定。栗瘿蜂Wolbachia的wsp基因片段为617 bp，已提交GenBank注册(注册号为DQ493720)。

2.2 栗瘿蜂共生Wolbachia的wsp基因序列分析及系统进化树的建立

将栗瘿蜂共生Wolbachia的wsp基因序列利用NCBI网站提供的BLAST分析工具，与GenBank中注册的瘿蜂种类共生Wolbachia的wsp基因序列进行了同源性比较(表 1)。栗瘿蜂体内的Wolbachia的wsp基因序列与GenBank中A大组的其他瘿蜂Wolbachia株的同源性在88.7%~83.9%之间，与同为产雌孤雌生殖的Plagiotrochus quercusilicis体内的wQue株的同源性最高。与B大组Ceroptres cerri体内的wCer株的同源性为82.9%。

利用Clustal X软件对所测得序列、GenBank中已知的其他瘿蜂以及A大组代表性菌株wSim和B大组代表性菌株wPip、wAlb的wsp基因序列进行排列，用PHYLIP软件进行1 000次的自导复制，获得了NJ系统进化树(图 2)。从系统进化树中可以看出，栗瘿蜂体内共生的Wolbachia与其他多数瘿蜂种类的共生菌株属于A大组。

3 结论与讨论

Wolbachia是节肢动物体内最为丰富的共生微生物之一(Werren, 1997)。本研究发现栗瘿蜂体内存在Wolbachia的共生，在NJ系统进化树中可以看出，栗瘿蜂体内的Wolba chia与大多数瘿蜂科种类的Wolbachia相同，属于A大组。

瘿蜂科昆虫的生殖方式比较复杂，有产雄孤雌生殖、产雌孤雌生殖以及周期性孤雌生殖；但是，其遗传机制尚不十分清楚(Hebert, 1987; Suomalainen et al., 1987)。Rokas等(2002)对欧洲的64种瘿蜂是否存在Wolbachia的共生进行了检测，仅仅7种检出了Wolbachia，检测种类的共生率较低，为10.9%。瘿蜂科Cynipini族的许多种类营周期性的孤雌生殖(Lijeblad et al., 1998; Ronquist, 1999)，对于存在Wolbachia共生的Cynipini族营产雌孤雌生殖的种类，Rokas等(2002)推测其祖先繁殖方式是周期性的孤雌生殖，由于Wolbachia的共生，而导致产雄孤雌生殖世代的缺失。但是，已知感染Wolbachia的种类中，既有产雌孤雌生殖的种类，也有周期性孤雌生殖及产雄孤雌生殖的种类(表 1)，可见Wolbachia对瘿蜂生殖的影响较为复杂。就栗瘿蜂而言，产雌孤雌生殖是否与共生的Wolbachia有关，调控机制如何，有待进一步探讨。