由于光合作用对人类生存和发展的重要性，关于植物光合作用的研究一直是生物学研究的热点。光合特性反映植物对外界物质的同化能力, 竹子具有生长快、产量高等特点，这意味着竹子具有较强的同化能力。通过对毛竹(Phyllostachys edulis)叶片净光合速率与光照强度、气温多元相关分析表明，日光合量与平均气温呈极显著线性正相关，呼吸速率与气温呈极显著相关，根据回归方程模型估算毛竹的年净光合量、年呼吸量分别为1.81×10⁴、2.00×10⁴mg CO₂·dm^-2a^-1(黄承才等，2000)。对9个毛竹种源新竹光合性状的研究结果表明，所有种源净光合速率在1年中有2个峰值, 第1次都在5月, 但第2次峰值随南北不同种源带有所差异，各种源带净光合速率随纬度的升高而呈现增大的趋势，各种源光补偿点的变幅在570~913 lx, 其中中带种源最低, 能更有效地利用光能(陈存及等，2001)。对雷竹(Phyllostachys praecox f.prevernalis)、绿竹(Bambusa oldhamii)的研究也得到了类似的结果，不同种源的净光合速率日变化呈双峰曲线，有明显的“午休”现象(郑炳松等，2001；黄勇，2003)。竹子作为高效生物质能源植物之一，其光合作用有着独特的生理规律，真正搞清竹子的高效光合机制仅从形态、生理角度进行研究有一定的局限性，如何更好地利用和调控竹子的光合效率，提高目标产量，需要在现有基础上开展竹子光合作用的分子机制研究。

捕光色素绑定蛋白基因属于光合系统基因(Raghvendra, 1998)，其编码的蛋白与色素所形成的色素蛋白复合体是一类捕获光能并把能量迅速传至反应中心引起光化学反应的色素蛋白复合体，在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外，在维持类囊体膜的结构，调节激发能在光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的分配，光保护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用(孙钦秒等，2000)。绿竹是我国原产的优良速生笋材两用丛生竹种之一。本研究以绿竹为材料进行光合捕光蛋白基因的克隆，以期为从分子水平来揭示竹子高效光合作用的机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 总RNA提取与cDNA合成

采用Invitrogen公司的Trizol reagent提取绿竹(源于浙江省温州)幼嫩新鲜叶片的RNA(Gao et al., 2006)，用Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA。采用Clontech公司的SMART^TM RACE试剂盒合成3′cDNA。

1.2 基因的克隆与测序

根据禾本科植物捕光叶绿素a/b结合蛋白基因家族中的同源基因序列设计PCR引物，由北京三博远志科技有限公司、上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

引物1：5′-AGCATCTGGTATGGACCTGAC-3′；引物2：5′-CCTGGACGAAGAATCCGAACA-3 ′；

引物3：5′-GCATCGCCCTCGTTAGAAC-3′；引物4：5′-GTCGTGCGTGGCTACTACAAG-3 ′；

引物5: 5′-CGTGCTCTACCTCGGTCCGCTCTCC-3′；引物6: 5′-TGACCCCGAGACCT TCGCTAAGAACCGC-3′。

以绿竹cDNA为模板，进行梯度PCR。引物1和引物2反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55~65 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，39个循环；72 ℃延伸10 min。引物1和引物4反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55~65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，39个循环；72 ℃延伸10 min。引物2和引物3反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55~60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，39个循环；72 ℃延伸10 min。引物3和引物4反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55~60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，39个循环；72 ℃延伸10 min。引物5和引物6的3′-RACE反应条件1为：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25个循环。引物5和引物6的3′-RACE反应条件2为：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，39个循环。

PCR产物电泳分析后用上海申能博彩生物科技有限公司试剂盒回收，按照Promega的p GEM-T easy载体快速连接试剂盒操作流程，将回收的DNA片段连接到载体上，转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α菌株，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆送北京三博远志科技有限公司测序。

1.3 序列的生物信息学分析

利用DNASTAR、SMART和Clustl W等生物软件分析测定cDNA序列及其编码蛋白质的结构特点，并与国际核酸和蛋白质数据库联网进行blast比较分析。

2 结果与分析 2.1 基因保守区片段的克隆与分析

用Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA作模板，引物1和引物2、引物1和引物4、引物3和引物2、引物3和引物4的PCR产物，在1%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色结果如图 1所示，引物1和引物2的产物在500 bp左右有一条亮带，引物1和引物4的产物、引物3和引物2的产物在700 bp左右都有一条亮带，与预测的基因片段基本相符，初步确定为目的基因片段。而引物3和引物4没有扩增产物(没有显示)。

用回收试剂盒回收PCR产物，并与pGEM-T easy载体连接，转化后得到的阳性克隆送公司测序。结果表明：引物1和引物2 PCR产物的插入片段为553 bp，引物1和引物4 PCR产物的插入片段为718 bp，引物3和引物2 PCR产物的插入片段为754 bp，与推断相符。应用DNASTAR软件和Blast在线软件，将测序的序列与已经报道的基因进行同源性比较，发现引物1和引物4 PCR产物和引物3和引物2 PCR产物的插入片段与cab基因家族有着较高的同源性，而且引物3和引物2 PCR产物的插入片段包含了基因的5′末端。

2.2 3′-RACE扩增与分析

为了获得基因的全长，根据测序克隆插入片段的序列分别设计了3′-RACE引物5和引物6，与SMART^TM RACE试剂盒通用引物(UPM)配对进行扩增，结果如图 2所示。引物5和UPM的PCR产物在800 bp左右有一条亮带，引物6和UPM的PCR产物在500 bp、700 bp左右各有一条亮带，将PCR产物回收并与pGEM-T easy载体连接后转化，在得到的大量克隆中，选取2个阳性克隆进行测序，插入片段大小分别为809 bp、767 bp，都含有终止密码子和Poly(A)结构，相似性为99%，证明得到了含有基因的3′末端的片段。

2.3 序列分析与cDNA全长的克隆

通过对测序基因片段序列的拼接获得了一个cDNA全长为1 102 bp的基因(GenBank登记号：EF061137)。对EF061137序列进行分析，结果显示该基因序列从第64 bp开始至861 bp含有1个开放阅读框(open reading frame，ORF)和1个终止密码子，编码265个氨基酸(图 3)。EF061137序列第64 bp开始的第1个起始密码子AUG上游第3个核苷酸为鸟嘌呤(G)，紧跟其后的核苷酸也为鸟嘌呤(G)，由此可见AUG起始密码子前后符合Kozak规则GNNAUGG(Kozak，1999)。此外，EF061137在5′端有63 bp的非编码区，在3′端含有213 bp的非编码区(untranslated region，UTR)和Poly(A)28 bp。在转录终止位点附近还有1个典型的加尾信号G/AATAA (在图 3中用下划线标出)，上述特征表明，该序列是一个完整的捕光叶绿素a/b结合蛋白基因，将其命名为cab-BO1 (cab gene from B. oldhamii)。

经过SMART软件和http://www.expasy.org/prosite/里面MOTIFSCAN选相分析，cab-BO1编码的氨基酸中第64~232位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain)，第9~11位为蛋白激酶C的磷酸化位点(protein kinase C phosphorylation site)，第27~52位为泛素结构功能域信号(ubiquitin domain signature)，第55~58位为酪氨酸激酶(CK2)磷酸化位点(casein kinase Ⅱ phosphorylation site)。此外，通过DNASTAR软件预测，cab-BO1编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.248和28 121.25 Da。

应用Mapdraw软件对获得基因序列分析发现，对引物3和引物2的PCR产物的测序片段以及引物5和UPM的PCR产物的测序片段都有SacⅠ单酶切位点，恰好位于两序列的重叠部分。为了获得含有完整序列的基因克隆，首先将引物3和引物2的PCR产物的测序的克隆用EcoRⅠ和SacⅠ双酶切后，将约440 bp的片段与pBI101载体连接，获得克隆A；再将引物5和UPM的PCR产物的测序克隆用PstⅠ和SacⅠ双酶切后，将约690 bp的片段与pUC19载体连接，获得克隆B；然后用HindⅢ和SacⅠ双酶切克隆A去除GUS片段后作为载体，将克隆B用HindⅢ和SacⅠ双酶切得到的约690 bp作为插入片段，连接后获得含有完整序列(1 102 bp)的基因克隆。

2.4 cab-BO1与cab家族基因的比较分析

通过blast软件分析，在NCBI核酸数据库中，与cab-BO1有同源性的cab家族基因或光合系统中的类似基因共有66条，这些基因来自玉米(Zea mays)、小果野蕉(Musa acuminata)、小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、松属(Pinus)植物、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等十几个不同的物种。Blast比较结果中的Score分值为228~965，其中cab-BO1与Y00379 (来源于玉米品种Golden Cross Bantam)序列相似性最高，Score分值为965, 一致性(identity)为90%(72 8/804)。在NCBI蛋白质数据库中，共搜索到与cab-BO1编码氨基酸有一定相似性的序列500条，Score分值在450以上的就有31条，其中相似性最高是玉米(登记号为P27497)，为92%(248/267)。图 4是cab-BO1编码的蛋白质与同源性靠前的5个不同物种蛋白质序列的Clustal W比较结果，相同氨基酸序列用^*标出。

3 讨论

在核酸及其编码蛋白的blast分析中发现，cab-BO1都与玉米的相似性最高，而来源于玉米的基因(X55892)编码的蛋白(P27497)为光系统Ⅱ的捕光叶绿素a/b结合蛋白(Viret et al., 1990)，因此推测在绿竹中cab-BO1编码的蛋白与色素所形成的色素蛋白复合体，作为光受体具有捕获光能并在光系统Ⅰ和系统Ⅱ传递激发能的功能。第64~ 232位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域，其功能可能是与色素分子结合；第9~1 1位为蛋白激酶C的磷酸化位点，第27~52位为泛素结构功能域信号，第55~58位为酪氨酸激酶(CK2)磷酸化位点，这些位点可能与该基因转录后的调节有关(Allen et al., 1997)。

cab家族基因在进化过程中，其cDNA序列是相当保守的(向太和等, 2005)。与禾本科中已经报道的cab家族基因聚类分析发现，绿竹与玉米的亲缘关系最近，接下来是水稻、小麦、大麦和两色蜀黍(Sorghum bicolor)，这为利用同源基因的进化来推断禾本科各属间的进化关系(Clark et al., 1995)提供了依据。

竹子光合作用的特征是异常的生长速度与生物量的增长，竹子四季常青的特点，使其成为重要的将太阳能转变为生物能量的潜在能源植物(Embaye，2001)。本研究首次从竹子中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因，为进一步研究竹子高效光合作用的分子机制奠定了基础，同时cab-BO1基因的克隆为研究cab家族基因在竹子中的功能创造了条件。然而，竹子基因功能的研究将是一个漫长而艰难的探索过程，下一步的研究工作需要建立完善的绿竹遗传转化体系，通过基因的过量表达和抑制或敲除来研究基因的功能。