松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)病是目前对森林构成严重威胁的一种松树萎蔫病，近几年被列为我国森林病虫害之首，目前还不能完全控制该病的发生、发展，其致病机理也还没有完全研究清楚。松树发生松材线虫病时，树体内发生一系列生理、生化变化。Oku(1995)报道感病松树显症时，树体内的苯甲酸(benzoic acid，BA)浓度显著升高，达到0.8 mmol·L^-1左右，这说明苯甲酸与松材线虫病相关。因此，研究苯甲酸在松材线虫病中的作用，有助于进一步研究其致病机理。

1 材料与方法 1.1 不同浓度的苯甲酸溶液对松枝和松材线虫的影响

在广东惠州市1株7年生健康马尾松(Pinus massoniana)树上，选取1年生枝条，剪下后带回实验室水培2 d后，选择生长状况一致的健康松枝用于试验。将苯甲酸(广州试剂厂生产，化学纯)加自来水配成10.24、5.12、2.56和1.28 mmol·L^-1的溶液。将松枝分别插入盛有上述不同浓度苯甲酸溶液的试管中培养，每个浓度处理3个重复，以自来水作对照。松材线虫来源于1株病树中刚分离的同一批线虫，将不同浓度的苯甲酸溶液各2 mL分别加于小瓶中，每瓶加入160条线虫，以自来水作对照，置于与松枝相同的环境中培养。每晚6时观察线虫死亡情况和松枝的症状变化，以松针全部枯萎为松枝死亡的依据。

1.2 1.00 mmol·L^-1苯甲酸溶液对松材线虫病的影响 1.2.1 松材线虫接种液的准备

松材线虫虫源由华南农业大学线虫室提供。将松材线虫在玻璃瓶中长满盘多毛孢(Pestalotia sp.)的玉米粒上培养，分离后线虫用无菌水反复冲洗5次，以无菌水配成每毫升5 000条松材线虫的接种液。

1.2.2 松枝的采集、接种与苯甲酸溶液培养

在广州市龙洞林场马尾松林中，选取20年生的健康马尾松树1株，剪取生长状况相似的健康松枝，带回室内水培24 h后，选择生长状况一致的松枝用于试验。参照谈家金等(2001)、赵博光等(2004)的方法在松枝下部纵切1 cm长的伤口至木质部，切口上加少许脱脂棉，以parafilm封口膜卷成筒状，套在松枝切口上。用接种枪在每个松枝上接种松材线虫接种液1.05 mL(3×0.35 mL)，接种后松枝分别插入盛有1.00 mmol·L^-1苯甲酸溶液(制备方法同1.1)和自来水的玻璃瓶中培养(瓶中加定量自来水或苯甲酸溶液，用胶纸封住瓶口以避免水分通过瓶口蒸发)。另以灭菌水接种松枝，以自来水培养作为对照。每处理6个重复。

1.2.3 病情观察和数据分析

每隔5天用电子天平测量1次松枝质量和玻璃瓶中的水液质量。玻璃瓶中减少的水量可视为松枝因蒸腾作用而消耗的水分，单位时间内玻璃瓶中减少的水量可视为松枝的蒸腾强度。为增加可比性，根据观察值计算以下相对变量：

观察针叶褐变现象；待所有松枝枯萎后，各松枝分别剪成1 cm的小段，分离、检查线虫数量。

2 结果与分析 2.1 不同浓度的苯甲酸溶液对松枝和松材线虫的影响

高浓度苯甲酸溶液处理的松枝针叶出现褐变现象，其中经10.24 mmol·L^-1的苯甲酸溶液处理的平均有75%的松针褐变，经5.12 mmol·L^-1的苯甲酸溶液处理的平均有30%的松针褐变。褐变从松枝最下部针叶的叶基部开始，逐渐向松枝上部和叶尖发展，褐变症状开始后很长时间内叶子不失水，也不萎蔫，直到对照松枝失水萎蔫时，其失水萎蔫症状才出现。低浓度苯甲酸溶液处理的松枝针叶没有褐变现象，经1.28 mmol·L^-1的苯甲酸溶液处理的松枝的存活期最长，与对照有显著差异。高浓度苯甲酸溶液处理的松材线虫在短期内即全部死亡，低浓度苯甲酸溶液处理的松材线虫则存活了较长时间。这说明，高浓度的苯甲酸溶液对松枝和线虫都有毒性，低浓度的苯甲酸溶液对两者的活性均有促进作用，但不同浓度的苯甲酸对松枝的失水萎蔫均没有表现出促进作用，反而有利于松枝针叶保持水分。

2.2 1.00 mmol·L^-1苯甲酸溶液对松材线虫病的影响

松材线虫病的主要症状是松树蒸腾作用显著下降和松针失水萎蔫，并有针叶褐变现象。本试验结果显示：相对蒸腾强度最小的是自来水培养的接种松枝，即其蒸腾强度下降最快；对照松枝和苯甲酸溶液培养的接种松枝的相对蒸腾强度较大，即其蒸腾强度下降较慢。各处理松枝的失水情况即相对质量与相对蒸腾强度相类似，相对质量依次是：苯甲酸溶液培养的接种松枝>对照松枝>自来水培养的接种松枝，即其失水程度依次升高。在处理后15 d时，各处理间有显著差异(表 2)。

各处理松枝平均存活期，以自来水培养的接种松枝最短，与其他处理有显著性差异。苯甲酸溶液培养的接种松枝没有针叶褐变现象，与自来水培养的接种松枝的针叶褐变株数有显著性差异(表 3)。

上述试验结果表明：1.00 mmol·L^-1苯甲酸溶液增强了松枝的抗病性，对松材线虫病有明显的抑制作用。

从所有的接种松枝中都分离到松材线虫，但由于在同一处理松枝中分离出的线虫量差异很大，分离出的线虫量在苯甲酸溶液培养的接种松枝与自来水培养的接种松枝之间经方差分析没有显著性差异(表 3)，这表明1.00mmol·L^-1的苯甲酸溶液至少没有抑制松材线虫在松枝中的生长繁殖。

3 结论与讨论

一些报道认为发病松树中存在的苯甲酸、苯乙酸等酚类代谢物质是病树中的致萎毒性物质。这些物质在健康松树中没有，但在松材线虫侵染早期, 它们就已产生, 随着在树体内的累积, 有可能抑制树体内的水分运输。但苯甲酸通常被认为是最简单的植保素(杜近义等，1999)，多种树木在遭受病虫侵害时会合成和积累苯甲酸，直接抑制病虫并诱导植物其他的抗性反应(叶建仁等，1996；于长春等，1997)。苯乙酸也广泛存在于生物体内，具有抗菌作用(Burkhead et al., 1998)，在树体内可转化成苯甲酸。

分析本试验结果，苯甲酸浓度在病树中显著升高应与松树抗病有关。1)用植物毒素处理寄主能产生与接种病原物相同的典型症状。但用苯甲酸处理松枝，其中毒症状仅表现为褐变，而不出现萎蔫，说明它并不影响松树的输水，这与松材线虫病树的水分运输受抑制无关，两者对松树的毒性机制可能不同。2)低浓度的苯甲酸对马尾松树枝和线虫活性都有促进作用，高浓度的苯甲酸对马尾松树枝和线虫活性都有抑制作用。松材线虫病中松材线虫和各种微生物的大量增殖和扩散都出现在松树水分输导受阻、形成层开始坏死后，即使这种症状是由于苯甲酸所直接引起，这时苯甲酸的浓度也相当高，在松树失水苯甲酸不断浓缩的情况下，线虫和各种微生物的增殖和扩散是不可能的。3)研究报道松树发病显示症状时，树体内的苯甲酸浓度仅为0.8 mmol·L^-1。本试验中，高达2.56 mmol·L^-1的苯甲酸溶液对松枝还没有显示出毒性作用，1.28mmol·L^-1的苯甲酸溶液对松枝生存仍有明显的促进作用，说明松树线虫病树中累积的苯甲酸不足以对松树产生伤害，而应该有促进松树生长力或抑制病害的作用, 只是由于感病树中累积的苯甲酸还不够多不够快，不足以抑制病害的发生、发展。4)本试验中，1.00 mmol·L^-1的苯甲酸溶液对接种了松材线虫的松枝的发病表现出明显的抑制作用，也说明在病树中苯甲酸浓度的升高与松树抗病有关。值得注意的是：虽然苯甲酸溶液处理的松枝发病得到控制，但其中的线虫仍能正常存活和增殖，这一方面表明松材线虫病的关健致病因子可能是某些致病微生物，松材线虫只是诱导因子，一方面表明了苯甲酸可能是通过直接抑制致病微生物或诱导松树的抗病性来抑制松材线虫病的。

用化学方法合成的纯品代替从病树中分离提纯的样品用于生物测定，其结果的可靠性更高。因为从病树中提纯的样品中，杂质有可能比真正的致萎毒性物质要多得多，从而产生错误的结果。

一般认为抗性大的品种，在受侵染后其酚类物质合成能力迅速增加，以抵抗病菌的侵入。而感病品种，虽然在病害发展后期酚类物质也有较多积累，但为时已晚，病害已蔓延，这在许多植物中得到证实(李会平等，2001；叶建仁等，1996)，松材线虫病的发生规律可能也是如此。选育受侵染后能迅速增加苯甲酸等酚类物质合成能力的树种，或采取措施迅速增加这些物质在树体内的含量，可能是防治松材线虫病及其他病害的有效途径之一。