板栗(Castanea mollissima)坚果在分类上虽属于干果，但其含水量高达45%~55%，采后生理特性接近水果，在贮藏过程中常因条件不当而大量腐烂，全国每年的损失约占总产量的25%(陈金印等，1996)。近年来，国内外科研工作者对板栗的贮藏保鲜的理论与技术进行了一系列研究，尤其是在采后通过低氧、高二氧化碳等处理提高板栗的贮藏保鲜效果等方面取得了一定的研究进展(王贵禧等，2000；2004；梁丽松等，2004)。作者在研究中发现，板栗采后通过水浴处理也可以提高耐藏性，所谓“水浴处理”就是将板栗浸入水中放置几天，使板栗发生轻微发酵，从而调节板栗的生理生化代谢，提高板栗的品质和耐藏性，但作者在预备试验中发现水浴处理会促进病原微生物的扩散和侵染，导致板栗腐烂率增加。为了控制病原菌的作用，在水浴处理时需要加入次氯酸钠作为消毒剂。有研究表明，次氯酸钠对种子的发芽幼苗的生长有影响(季梦成等，2000；王首锋等，1996)，说明次氯酸钠除作为消毒剂外，可能对种子的生理代谢也产生作用。板栗坚果在植物学上属于种子，为了探讨次氯酸钠在板栗水浴处理中的生理作用，本研究以‘燕昌’板栗为试材，研究不同浓度NaClO水浴处理对板栗在MA贮藏期间生理生化变化的影响，为板栗的采后处理提供理论基础和技术依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用板栗采自北京市昌平区下庄，品种为‘燕昌’(Castanea mollissima cv.Yanchang)。采后运至中国林业科学研究院林业研究所林果保鲜实验室，进行不同浓度NaClO水浴处理。

1.2 试验方法

板栗分别在不同浓度NaClO水溶液(100 mg·L^-1、500 mg·L^-1、1 000 mg·L^-1)中水浴处理[水:果(V/V)= 3:2]，水温为15~16 ℃。每处理10 kg，重复3次。当水浴处理溶液的pH下降到5.0时(约3天)，将板栗取出，晾干至原重后，装入0.04 mm聚乙烯塑料薄膜保鲜袋(PE)中于冷库内进行自发气调(MA)贮藏，以不做任何处理的MA贮藏板栗为对照(CK)，贮藏条件按前文(王首锋等，1996)，在贮藏期间O₂和CO₂浓度的变化范围分别为13.1%~16.3%和5.2%~8.6%。在贮藏期间定期取样进行相关生理指标测定，其中PPO和POD的取样又分为板栗种仁内部和外部组织，内部是子叶心部胚芽周围组织，外部是子叶外围2~4 mm组织。

1.3 测定指标与方法 1.3.1 呼吸强度测定

气相色谱法(王贵禧等，1999)。

1.3.2 淀粉酶活性测定

采用李合生(2001)的方法。

1.3.3 乙醇脱氢酶(ADH)活性测定

参照刘祖棋(1994)的方法。

1.3.4 多酚氧化酶(PPO)活性测定

采用邻苯二酚比色法，参照Galeazzi等(1981)的方法，加以改进。

提取液的制备：取3 g果肉(分为内部和外部)，加0.5 g PVPP于20 mL 0.2 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH=6.4)中，冰浴研磨，4 ℃低温离心机9 000 r·min^-1离心30 min，取上清液测定酶活性。

酶活性测定：将0.2 mL粗酶提取液加入3 mL 0.1 mol·L^-1的邻苯二酚溶液(用0.2 mol·L^-1 pH 6.4的磷酸缓冲液配成)中。反应温度为25 ℃，加酶液后5 s开始扫描20 s内398 nm处吸光值变化，以每分钟△OD₃₉₈增加0.01表示一个酶活性单位(U)。

1.3.5 过氧化物酶(POD)活性测定

酶液提取同PPO。酶活性测定采用愈创木酚比色法，参照Putter等(1974)的方法，稍作修改。将0.1 mL粗酶提取液加入2 mL 0.05mol·L^-1愈创木酚(用0.2 mol·L^-1 pH 6.4的磷酸缓冲液配成)中，在34 ℃水浴中平衡5 min，然后加1 mL 0.2% H₂O₂(用0.2 mol·L^-1 pH 6.4的磷酸缓冲液配成)混匀，10 s后扫描1 min内470 nm处吸光值变化，以1 min △OD₄₇₀增加0.01表示一个酶活性单位(U)。

1.3.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

采用氮蓝四唑比色法(李合生，2001)。粗酶的提取：取果肉5 g于预冷的研钵中，加入50 mmol·L^-1 10 mL pH 7.8(内含1%PVP40)的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆，于4 ℃下12 000 r·min^-1离心15 min，分离出的上清液即为粗酶液。

1.3.7 过氧化氢酶(CAT)活性测定

采用紫外吸收法(陈建勋等，2002)。粗酶的提取同SOD，在反应体系中，包括2 mL 50 mmol·L^-1 pH 7.8的磷酸缓冲液和1 mL 0.25%的H₂O₂，最后加入0.05 mL粗酶液启动反应。测定240 nm波长处的OD值降低速度，以1 min内△OD₂₄₀减少0.01个单位为一个酶活性单位(U)。

1.4 数据处理

差异显著性分析：采用SPSS软件，进行邓肯氏新复极差测验。

2 结果与分析 2.1 不同浓度NaClO水浴处理对呼吸作用的影响

呼吸作用强弱是板栗生理状态的重要标志。如图 1所示，在贮藏初期，板栗呼吸旺盛，各处理和对照板栗的呼吸强度均较高。随着贮藏期延长，板栗的呼吸强度迅速降低，表明板栗逐渐进入休眠状态，在60~150 d时为休眠期，之后休眠解除，呼吸上升。NaClO水浴处理的板栗呼吸强度总体低于对照，贮藏120 d时，各处理的呼吸强度降到最低，500 mg·L^-1 NaClO处理的呼吸强度仅为1.83 mg CO₂·kg^-1h^-1，与对照存在着极显著性差异(P=0.01)。在贮藏结束时，500 mg·L^-1 NaClO和1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理的板栗呼吸强度显著低于100 mg·L^-1 NaClO水浴处理和对照(P=0.01)。说明NaClO水浴处理对板栗呼吸强度有显著抑制作用，且抑制程度与NaClO溶液的浓度有关，500 mg·L^-1 NaClO和1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理对呼吸的抑制作用最明显。

2.2 不同浓度NaClO水浴处理对淀粉酶活性的影响

淀粉是板栗主要的贮藏物质，淀粉酶活性的高低直接影响板栗在贮藏期间淀粉的降解。试验结果表明(图 2)，处理结束时，各处理板栗的淀粉酶活性均高于对照，说明水浴处理在处理期间促进了淀粉酶活性的升高。贮藏30 d时，各处理与对照板栗的淀粉酶活性均显著升高，且对照板栗的淀粉酶活性高于NaClO水浴处理。在以后的贮藏过程中，各处理与对照板栗淀粉酶活性均随着贮藏时间的延长逐渐降低，且NaClO水浴处理板栗的淀粉酶活性始终低于对照，直至贮藏结束。研究结果表明，淀粉酶活性的变化趋势与淀粉含量的变化趋势相对应(研究结果另文发表)，淀粉酶活性与淀粉的含量呈负相关。不同浓度NaClO水浴处理间也有差异，除180 d 1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理的淀粉酶活性有升高之外，总体来看500 mg·L^-1 NaClO和1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理的淀粉酶活性较低。

2.3 不同浓度NaClO水浴处理对板栗PPO活性的影响

贮藏期间，板栗的内部PPO、外部PPO活性的变化均呈上升趋势，且在贮藏60 d以后各处理与对照板栗的外部PPO活性均显著高于内部PPO活性(图 3)。在贮藏过程中，板栗内部PPO活性逐渐增加，而外部PPO活性则在贮藏的前60 d迅速增加，在以后的贮藏过程中则基本维持在这一水平，直到贮藏结束。

如图 3(A)可见，在贮藏过程中，NaClO水浴处理板栗的内部PPO活性始终显著低于对照板栗(P=0.05)。贮藏30 d时，NaClO浓度越高的处理板栗的内部PPO活性越低，贮藏60 d和120 d时，100 mg·L^-1 NaClO和500 mg·L^-1NaClO水浴处理板栗的内部PPO活性相当，显著高于1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理板栗的值(P=0.05)。贮藏结束时，对照板栗的内部PPO活性最高，与NaClO水浴处理有显著差异(P=0.05)，500 mg·L^-1 NaClO水浴处理的板栗内部PPO活性最低。如图 3(B)可见，在整个贮藏期间，1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理板栗的外部PPO活性始终显著高于其他处理和对照(P=0.05)，而100 mg·L^-1 NaClO和500 mg·L^-1 NaClO水浴处理板栗的外部PPO活性则始终显著低于对照(P=0.05)，但这2个浓度之间则没有显著差异。

以上结果说明，不同浓度NaClO水浴处理抑制了板栗在贮藏期间内部PPO的活性升高，尤以500 mg·L^-1 NaClO和1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理板栗抑制效果好；但对外部PPO活性而言，低浓度NaClO(100、500 mg·L^-1)水浴处理对PPO活性的升高有抑制作用，但高浓度(1 000 mg·L^-1)处理则促进了PPO活性的升高。从NaClO水浴处理对板栗内部和外部PPO活性的总体抑制效果来看，以500 mg·L^-1 NaClO水浴处理效果好。

2.4 不同浓度NaClO水浴处理对板栗POD活性的影响

板栗外部组织的POD活性显著高于内部组织的POD活性，且随着贮藏时间的延长，外部POD活性变化幅度较大，而内部POD活性变化幅度相对较小(图 4)。

图 4(A)是板栗内部组织POD活性变化，各处理和对照的内部POD活性在贮藏过程中略有上升。在贮藏120 d前，对照内部POD活性与100 mg·L^-1和500 mg·L^-1 NaClO处理的值相当，但显著高于1 000 mg·L^-1NaClO处理的值(P=0.05)。在贮藏120 d以后，对照内部POD活性呈急剧降低趋势，而1 000 mg·L^-1 NaClO处理的内部POD活性急剧升高，100 mg·L^-1和500 mg·L^-1NaClO处理的内部POD活性变化不大。到贮藏180 d时，NaClO处理的内部POD活性高于对照，其中1 000 mg·L^-1 NaClO处理的内部POD活性与对照存在显著差异(P=0.05)。图 4(B)是板栗外部组织POD活性变化，对照外部组织POD活性在贮藏60 d时活性达到高峰，显著高于处理前的值(P=0.01)，之后又明显降低。NaClO处理的外部POD活性在贮藏的前120 d持续显著升高，尤其是1 000 mg·L^-1 NaClO处理，其外部POD活性在60 d前急剧增加，显著高于其他处理(P=0.01)。贮藏120 d时，不同浓度NaClO处理的外POD活性均达到最大值，显著高于对照(P=0.05)。贮藏180 d时，各NaClO处理的外部POD活性均显著降低，其中500 mg·L^-1 NaClO处理的值显著高于其他处理和对照(P=0.05)，1 000 mg·L^-1 NaClO处理与对照相当，100 mg·L^-1 NaClO处理最低。

2.5 不同浓度NaClO水浴处理对板栗SOD活性的影响

不同浓度NaClO水浴处理的板栗SOD活性变化存在差异(图 5)。100 mg·L^-1和500 mg·L^-1 NaClO处理的板栗SOD活性在贮藏期间变化不大，前者在贮藏120 d以后稍有降低，后者在贮藏60 d时略有增加后又降低到入库时的水平；而1 000 mg·L^-1 NaClO处理的板栗SOD活性则在贮藏60 d后迅速降低，在贮藏180 d时，其SOD活性与入库时相比显著降低(P=0.05)。对照板栗SOD活性在贮藏60 d前没有明显变化，贮藏60 d后则一直降低。综合比较来看，100 mg·L^-1和500 mg·L^-1 NaClO水浴处理在贮藏期间比对照和1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理的SOD活性高；在贮藏的前120 d，1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理和对照的SOD活性相当；在贮藏180 d时，1 000 mg·L^-1 NaClO处理的SOD活性显著降低，且显著低于其他处理和对照(P=0.05)，100 mg·L^-1和500 mg·L^-1 NaClO水浴处理的SOD活性高于对照，其中500 mg·L^-1 NaClO处理与对照有显著差异(P=0.05)。以上结果说明500 mg·L^-1 NaClO水浴处理有利于板栗SOD活性的保持。

2.6 不同浓度NaClO水浴处理对板栗CAT活性的影响

整个贮藏期间，NaClO水浴处理板栗的CAT活性均显著高于对照(P=0.05)，但处理和对照的变化趋势相似(图 6)。对照贮藏120 d期间CAT活性迅速降低，而500 mg·L^-1和1 000 mg·L^-1NaClO处理的板栗CAT活性几乎没有变化，100 mg·L^-1NaClO处理的在贮藏120 d时活性较其他2个处理低但高于对照；在贮藏120 d以后，各处理和对照的CAT活性均显著升高，贮藏180 d时，1 000 mg·L^-1 NaClO处理的CAT活性最高，显著高于其他2个处理(P=0.05)和对照(P=0.01)，100 mg·L^-1和500 mg·L^-1 NaClO处理的CAT活性相当，对照的CAT活性最低，显著低于NaClO处理的值(P=0.05)。以上结果表明，不同浓度的NaClO水浴处理有利于保持板栗CAT活性，500 mg·L^-1和1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理优于100 mg·L^-1 NaClO水浴处理。

3 讨论

呼吸作用的强弱是板栗生理状态的重要标志，板栗的呼吸速率不仅受外界环境条件的影响，还受组织内部生理状态的控制。一般说来，呼吸强度越大，衰老就越快，耐藏性就越差。采后的板栗坚果，是一种含淀粉量高、含水量高且不能干藏的特殊种子，贮藏期间呼吸强度的变化是影响其贮藏性的关键因素。本试验结果表明，水浴处理并未改变果实呼吸的动态趋势，只是使呼吸强度减弱，从而降低了相应的代谢活动，延缓了果实的衰老，有利于板栗的贮藏。

淀粉酶活性的高低直接影响淀粉含量的多少，也影响可溶性糖的含量。本试验结果表明，在整个贮藏期间，淀粉酶活性呈先升后降的动态变化趋势。在冷藏一个月左右出现酶活性高峰，这与王小明等(2001)的研究结果一致。在整个冷藏过程中，以对照的淀粉酶活性最高，500 mg·L^-1 NaClO水浴处理的淀粉酶活性最低，且与对照存在显著差异。这说明适当浓度NaClO水浴处理能不同程度地抑制板栗在冷藏期间的淀粉酶活性的升高。研究中还发现，适当强度的水浴处理有利于板栗坚果淀粉的保持，淀粉酶活性与淀粉含量负相关。

在许多水果中已发现PPO活性与果肉褐变程度有明显的正相关(McGuire，1992)。陶月良等(2001)研究表明，板栗果肉中POD活性与褐变强度存在显著相关性，而与PPO活性无明显相关性，认为板栗果实中催化褐变反应的酶主要为POD。Larrigaudiere等(1998)则认为，果肉褐变不仅是酶褐变的间接结果，而且也是其他氧化或衰老过程的信号。本研究发现，NaClO水浴处理使板栗内部PPO活性降低，对外部PPO活性的影响与NaClO浓度相关，1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理使板栗外PPO活性一直高于对照，而100 mg·L^-1NaClO和500 mg·L^-1 NaClO处理使外PPO活性降低，且板栗发生不同程度的褐变，外部组织比内部组织的褐变程度严重。这说明PPO在板栗衰老褐变中起着重要作用。

自由基伤害学说认为，逆境胁迫使植物活性氧自由基产生和清除的平衡系统遭到破坏，自由基的积累增加，导致膜脂的过氧化加剧，细胞膜结构遭到破坏，膜透性增大，进而导致代谢障碍(Remon et al., 2000；谢耀坚，1991；王洪春，1985)。POD、CAT、SOD等保护酶可以有效地清除果实体内的活性氧，防止膜脂的过氧化作用，从而减轻伤害，延缓衰老。本研究结果表明，水浴处理使板栗内部POD活性降低，对外部POD活性的影响与NaClO浓度相关，1 000 mg·L^-1 NaClO水浴处理使板栗外部POD活性增加，其他处理在贮藏前期降低了外部POD活性，但在后期使外部POD活性升高；100 mg·L^-1 NaClO和500 mg·L^-1 NaClO水浴处理使板栗SOD活性升高，而1 000 mg·L^-1 NaClO处理则使SOD活性降低；水浴处理板栗的CAT活性变化趋势与对照相同，但高于对照。这说明水浴处理能使板栗在MA贮藏期间的POD、CAT、SOD活性维持在一个较高的水平，对板栗的代谢具有较好的调节作用，有效地抑制板栗的衰老，有利于板栗的贮藏。但是水浴处理会使板栗ADH活性升高，关于ADH升高后对板栗坚果生理和品质影响的评价还需要进一步深入研究。