蛋白质提取是蛋白质研究及酶学分析等许多工作的基础。但是由于蛋白质组研究相关技术体系建立时间较短，仍存在许多有待改进之处，特别是在蛋白质样品制备方面(兰彦等, 2001)。野生植物尤其是木本植物中往往含有大量的多酚和醌等次生代谢物质，它们能与蛋白质和核酸等生物大分子发生结合反应，给提取带来很大麻烦。多酚最具特征性的反应之一便是与蛋白结合产生沉淀(石碧等, 2000)。另外，在提取过程中，多酚容易氧化成醌类物质，后者与蛋白质的氨基和巯基反应，导致蛋白质失活，并加剧蛋白质沉淀，同时使组织提取液变成棕色，严重影响蛋白质的提取效率及品质(王中仁, 1996；Borneman et al., 2001)。

一般认为，蛋白质-多酚的结合作用是通过在蛋白质表面形成多配位键(包括疏水作用和氢键)，使分离的蛋白质产生交联(Haslam, 1988; Feldman et al., 1999; Carvalho et al., 2004; Hagerman et al., 1981; Asquith et al., 1986)。蛋白质-多酚的结合是可逆的，受多种因素的影响：蛋白质结构、蛋白质和单宁的浓度、溶剂成分、离子强度、pH值和其他物质，如多糖等。一般而言，高pH值环境或有机溶剂都会减少多酚与蛋白质的结合(Asquith et al., 1986; Hagerman et al., 1978；1981; Carvalho et al., 2004; Naczk et al., 1996；2006)。人工合成的多聚体，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯多聚吡咯烷酮(PVPP)及聚乙二醇(PEG)，常被用于去除提取液中的多酚(Jones, 1965)。PVPP具有类似蛋白质的内酰胺结构，具有较强的生物相容性和极性，可以通过其内酰胺结构中的N原子和O原子与多酚形成氢键，从而吸附多酚并使其从溶液中沉淀下来(黎新明等，2002)。

麻栎(Quercus acutissima)种子含有丰富的多酚(杜怡斌, 2000)，在材料的处理过程中易发生褐变，试验中发现，常规的提取方法(Aebi，1983；Knorzer et al., 1996)不能有效获得蛋白质。本文针对多酚与蛋白质结合的特性，采取了抑制两者结合以及去除多酚的措施来探讨有效提取麻栎种子中蛋白质的最优方法。

1 试验材料与方法 1.1 试验材料

试验材料为麻栎种子，2004年采集于中国科学院植物研究所植物园内。9月份待果皮由绿色转为褐色时，从母树摇落。种子收集后进行清选，去除壳斗、杂质及受到虫害的种子，室内通风处风干12 h后装入尼龙编织袋内，贮藏于5 ℃备用。在冰浴条件下用刀片将种子切碎，经液氮冷冻研磨成粉末，分装后贮存于-70 ℃低温冰箱中备用。

1.2 蛋白质含量测定

采用Bradford(1976)的考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。

1.3 常规提取

参照Aebi (1983)和Knorzer等(1996)的方法，采用复杂的Tris-HCl缓冲液[50 mmol·L^-1, pH7.0, 含有1 mmol·L^-1乙二胺四乙酸钠(EDTA), 1 mmol·L^-1抗坏血酸(AsA), 1 mmol·L^-1二硫苏糖醇(DTT)，1 mmol·L^-1还原性谷胱甘肽(GSH), 5 mmol·L^-1MgCl₂, 0.05%Triton X-100和20%甘油, 以及1% PVPP]进行提取。准确称取0.2 g材料，加2 mL上述缓冲液，冰浴研磨，充分匀浆后转入2 mL Ep管，2次离心(10 000×g, 4 ℃, 6 min; 15 000×g, 4 ℃, 15 min)后，取上清液测定蛋白质含量。离心后的沉淀分别用0.1 mol·L^-1 NaOH或者0.5%Na₂CO₃溶解(碱解)，15 000×g, 4 ℃条件下离心15 min，测定上清液蛋白质含量。

1.4 提取比例对蛋白质提取率的影响

采用上述提取缓冲液，按照材料:提取缓冲液(W:V)分别为1:10、1:5和1:2的比例提取蛋白质，提取方法同上。

1.5 提取缓冲液种类对蛋白质提取率的影响

分别采用上述Tris-HCl缓冲液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(简称磷酸钠缓冲液, PBS, 50 mmol·L^-1, pH7.0, 含有1 mmol·L^-1 EDTA, 1 mmol·L^-1 AsA, 1 mmol·L^-1 DTT, 1 mmol·L^-1 GSH, 5 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.05%Triton X-100和20%甘油, 以及1% PVPP)，按照相同的提取比例(1:5)和方法提取蛋白质。

1.6 提取缓冲液pH值对蛋白质提取率的影响

采用pH值分别为7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0和11.5的Tris-HCl提取缓冲液(50 mmol·L^-1, 含有1 mmol·L^-1 EDTA, 1 mmol·L^-1 AsA, 1 mmol·L^-1 DTT, 1 mmol·L^-1 GSH, 5 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.05%Triton X-100和20%甘油, 以及1% PVPP)，按照上述方法提取蛋白质。

1.7 PVPP用量对蛋白质提取率的影响

研磨时，分别按照材料:PVPP用量(W:W)为1:0.25, 1:0.5和1:1的比例，将PVPP粉末直接加入研钵，与材料一起研磨，待研磨成粉末后，加入上述Tris-HCl缓冲液，按照上述方法提取蛋白质。由于加入与材料等量的PVPP时，材料匀浆已经很粘稠，考虑到试验方便性，不再采用更大量的PVPP。

1.8 正交试验设计

根据单因素试验结果，进行正交优化试验。选择缓冲液种类、缓冲液pH值和PVPP用量作为影响因素，进行L9 (3³)正交试验设计。试验因素和水平见表 1。

3种提取缓冲液均含有相同的保护物质。加入PVPP与材料一起研磨，提取方法同上。

1.9 丙酮沉淀法提取蛋白质

参照林金科等(2003)介绍的丙酮提取法提取麻栎种子中的蛋白质。

2 试验结果及分析 2.1 常规提取

采用常规的提取缓冲液进行提取，上清液里几乎不能测得蛋白质，而离心后的沉淀经碱解以后，可获得7.9 mg·g^-1鲜质量(FW, fresh weight)蛋白质。说明提取液中的蛋白质被沉淀，而经碱解以后可以获得较多的蛋白质，初步表明种子中的蛋白质可能已被多酚沉淀。

2.2 提取比例对蛋白质提取率的影响

按照材料:提取缓冲液(W:V)分别为1:10、1:5和1:2的比例提取蛋白质，获得的蛋白质量略有差别，分别为：不能测得、(0.69±0.01) mg·g^-1 FW和(0.31±0.10) mg·g^-1 FW，其中以1:5的提取效果略好，过低或者过高的提取比例都会降低蛋白质获得率。但提取得到的蛋白质量仅为沉淀经碱解获得的蛋白质量的1/10，效果甚微。

2.3 提取缓冲液种类对蛋白质提取率的影响

提取缓冲液的种类对蛋白质的提取有影响，磷酸盐缓冲液的提取效果好于Tris-HCl缓冲液，相同提取条件下，Tris-HCl和PBS分别获得蛋白质(0.69±0.01) mg·g^-1 FW和(1.25±0.32) mg·g^-1 FW，差异显著(P＜0.05)。有文献表明，Tris-HCl缓冲液会抑制某些酶蛋白的活性(王中仁, 1996; 吴冠芸等, 2003)，而且Tris-HCl缓冲液的pH值对温度敏感性高于磷酸盐缓冲液，可能是提取效果不如磷酸盐缓冲液的原因。

2.4 提取缓冲液pH值对蛋白质提取率的影响

提取缓冲液pH值对蛋白质的提取有较大影响(图 1)。缓冲液pH值由7.0逐步升高，蛋白质提取率逐步升高，此规律在pH值7.0~ 9.5之间更为明显；pH值继续升高，蛋白质提取率上升幅度减小。此试验结果与茶叶蛋白质提取相一致(王洪新等, 2004)。提取液呈棕褐色，而且提取缓冲液pH值越高，提取液颜色越深。pH值影响麻栎种子蛋白质的提取可能有2个原因：一是蛋白质的等电点不同，不同的pH值条件下，蛋白质的溶解度不一样；二是碱性环境抑制多酚与蛋白质的结合，同时酚氧化酶把酚转化成醌类物质，后者将和蛋白质的氨基和硫氢基反应，使提取液变成棕色(王中仁, 1996)。

2.5 PVPP用量对蛋白质提取率的影响

试验结果表明PVPP用量显著影响麻栎种子蛋白质的提取率(图 2)。材料:PVPP用量为1:0.01, 1:0.25, 1:0.5和1:1时，测得蛋白质含量分别为(0.31±0.10)、(2.90±0.10)、(8.54±0.60)和(21.14±0.98) mg·g^-1 FW。随着PVPP用量的增加，蛋白质提取率显著增加(P＜0.01), 可见PVPP可大量吸附并沉淀材料中的多酚，从而促进蛋白质的溶解。

添加大量PVPP后提取出的蛋白质可以测得酶蛋白有活性，说明采用该方法提取的蛋白质保持活性状态，证明PVPP具有保护酶活性的作用。汪昌俊等(2000)在对茶树(Camellia sinensis)鲜叶中β-葡萄糖苷酶的研究中发现，PVPP用量从1:0增加到1:1时，蛋白质提取比率显著增加，酶活性也显著增加。肖厚荣等(2003)对烟草(Nicotiana tabacum)中硝酸还原酶的研究也发现，在一定范围内，硝酸还原酶的活性随着PVP用量的增加而增强。

另外，样品研磨中加入PVPP，不但可以有效吸附多酚等物质，而且还可起到类似石英砂的作用，增大样品研磨面积，使得样品破碎得更为完全。

2.6 正交试验

由表 2可以看出，各因素的主次顺序为C、A、B，即PVPP用量、缓冲液种类、缓冲液pH值。经分析得出，麻栎种子蛋白质的最佳提取条件为C₃A₂B₂，即采用pH 7.5的磷酸钾提取缓冲液，材料:PVPP用量为1:1，采用该条件所提取的蛋白质量为(21.87±2.89) mg·g^-1 FW，显著高于其他条件(P＜0.01)。

各因素的影响水平见图 3，其中PVPP用量的影响是1:1>1:0.5>1:0.25，与单因素试验结果一致。缓冲液种类的影响效果是磷酸钾>磷酸钠>Tris-HCl缓冲液。缓冲液pH值的影响效果是7.5>7.0>8.0。pH值的影响与单因素试验的结果不一致，可能是由于缓冲液的pH值与PVPP相互作用引起的。有试验表明，PVPP对多酚的吸附作用在酸性或者中性条件下最好，pH过高会影响PVPP对多酚的吸附作用(王中仁, 1996)。

2.7 丙酮沉淀法

丙酮作为一种有机溶剂，在蛋白质提取中主要有两方面的作用：一是沉淀蛋白质；二是作为多酚、色素等物质的优良溶剂，可以去除多酚等的影响。但在本试验中，采用丙酮沉淀法提取蛋白质，只获得(6.65±0.43) mg·g^-1 FW蛋白质，显著低于正交试验中最佳提取条件所获得的蛋白质量(P＜0.01)。而且此法操作复杂，对温度条件要求较严格，操作不当易使蛋白质凝结变性。丙酮沉淀以后蛋白质的溶剂要求复杂，容易造成蛋白质溶解不完全。这种提取方法通常应用于蛋白质电泳中蛋白质的提取，用裂解液可以充分溶解蛋白质沉淀，但是此法提取的蛋白质已经变性，不适用于酶学分析。

3 结论与讨论

由单因素和正交试验结果可以看出，诸多试验因素影响麻栎种子中蛋白质的提取效果，包括提取缓冲液的种类、缓冲液的pH值和PVPP的用量。经正交试验优化确定麻栎种子蛋白质的最佳提取条件为：采用含有1 mmol·L^-1 EDTA, 1 mmol·L^-1 AsA, 1 mmol·L^-1 DTT, 1 mmol·L^-1 GSH, 5 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.05%Triton X-100和20%甘油的50 mmol·L^-1磷酸钾缓冲液(pH值7.5)，加入与材料同等量的PVPP与材料共同研磨提取。

文章所涉及的因素中，影响最大的因素为PVPP的用量。在通常的试验中，采取在缓冲液中添加1%~2%的PVPP。Walker等(1974)研究表明PVP肽键中的氧与酚羟基上的质子牢固地结合，从而防止酚与酶中的肽键结合，可以保护酶蛋白；但PVP加入量过多也可与蛋白质的肽键结合而抑制酶的活性。于凤鸣(1999)在研究玫瑰香葡萄(Vitis vinifera cv.Muscat)、桃(Amygdalus persica)、杏(Armeniaca vulgaris)叶片中POD活性时也发现，随着缓冲液中PVP加入量的增加，POD活性逐渐升高，继续加入PVP，活性则下降。可能是PVP结合并抑制了POD的活性。但是，麻栎种子中多酚含量较高，采用1%的PVPP几乎不能提取出蛋白质，而当PVPP用量增加到1:1时，才能有效提取出蛋白质。提取缓冲液的种类对蛋白质的提取效果也有较大的影响，本试验范围内以磷酸钾缓冲液的效果为最好。

另外从正交试验结果可以看出，各种因素的影响作用并不是独立的，往往存在相互的作用，如缓冲液pH值与PVPP的用量之间存在相互影响。在试验中盲目地照搬前人的方法是不可取的，不同试验材料的最适提取条件不尽相同，而正交试验设计是一个很好的化繁为简的工具。