林业科学  2007, Vol. 43 Issue (1): 111-115   PDF    
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廖太林, 李百胜, 叶建仁, 纪睿, 吴翠萍, 安榆林, 陈建东.
Liao Tailin, Li Baisheng, Ye Jianren, Ji Rui, Wu Cuiping, An Yulin, Chen Jiandong.
松树脂溃疡病菌的分子检测
Molecular Detection of Fusarium circinatum, the Causal Agent of Pine Pitch Canker
林业科学, 2007, 43(1): 111-115.
Scientia Silvae Sinicae, 2007, 43(1): 111-115.

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收稿日期:2006-03-09

作者相关文章

廖太林
李百胜
叶建仁
纪睿
吴翠萍
安榆林
陈建东

松树脂溃疡病菌的分子检测
廖太林1,2, 李百胜2, 叶建仁1, 纪睿2, 吴翠萍3, 安榆林3, 陈建东3     
1. 南京林业大学 南京 210037;
2. 江苏昆山出入境检验检疫局 昆山 215301;
3. 江苏出入境检验检疫局 南京 210009
关键词:松树脂溃疡病菌    分子检测    巢式PCR    
Molecular Detection of Fusarium circinatum, the Causal Agent of Pine Pitch Canker
Liao Tailin1,2, Li Baisheng2, Ye Jianren1, Ji Rui2, Wu Cuiping3, An Yulin3, Chen Jiandong3     
1. Nanjing Forestry University Nanjing 210037;
2. Kunshan Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau of Jiangsu Province Kunshan 215301;
3. Jiangsu Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau of China Nanjing 210009
Abstract: Fusarium circinatum, the causal agent of pitch canker disease, causes several serious diseases of pines. The pathogen infects a variety of vegetative and reproductive pine structures at different stages of maturity and produces a diversity of symptoms. Long distance spread of the disease occurs when materials infected with the pitch canker fungus are transported to pest free_area. Preventing disease spread is important because once pitch canker becomes established in area there is no way to stop it from infecting and killing trees. The objectives of our study was to establish a fast and reliable diagnostic test for the presence of F. circinatum. The oligonucleotide primers G1/G2 (5′-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3′/5′-ACTCACGGCCACCAAACCAC-3′), derived from the differentiation of intergenic spacer (IGS) regions within fungi, amplified a single 873 bp product from Fusarium spp.. The IGS DNA sequences of Fusarium spp. were gained from GenBank. Oligonucleotide primers S1/S2 (5′-CTTACCTTGGCTCGAGAAGG-3′/5′-CCTACCCTACACCTCTCACT-3′), derived from IGS DNA, amplified a product of 364 bp which was unique to F. circinatum. The nested-PCR using primers G1/G2 and S1/S2 identified F. circinatum from other Fusarium spp.. This PCR assay was proved to be highly sensitive with the detection limit of 5×10-3 pg·μL-1 genomic DNA or 10 spores·(100 μL)-1 H2O. The result indicates that the nested-PCR could successfully used to detect the presence of F. circinatum directly from infected plant tissue.
Key words: Fusarium circinatum    molecular detection    nested-PCR    

松树脂溃疡病(Fusarium circinatum)为美国、南非等国外针叶树上发生的一种危险性林木病害(Storer et al., 1994; Viljoen et al., 1994)。该病害常引起寄主树干流脂溃疡、雌花和球果坏死、种子变质以及苗木枯死。其病原菌可随种子、苗木、病木木材、媒介生物以及黏附土壤进行远距离传播。日本1989年(Kobayashi et al., 1989)、墨西哥1991年(Guerra et al., 1991)、南非1994年(Viljoen et al., 1994)、智利2001年(Wingfield et al., 2001)等地相继发现有松树脂溃疡病为害,该病害在世界各地呈现出迅速蔓延之势。

松树脂溃疡病菌分类上被认为是李瑟组镰刀菌(Fusarium section Liseola)的1个种,其有性阶段为Gibberella fujikuroi (sawada) Ito & Kimura中的交配群H(Steenkamp et al., 1999)。除上述交配群外,G. fujikuroi至少还包括另外7个在遗传上完全不同的交配群,分别以A、B、C、D、E、F、G命名(Britz et al., 1999)。不同交配群具有定殖于特定寄主的倾向(Elmer, 1995)。开展松树脂溃疡病菌检疫鉴定常常需要同时进行致病性测定或与已知标准菌株进行有性杂交,常规检疫鉴定方法费时费力,有时结果还不准确。Viljoen等(1997)Steenkamp等(1999)以及Schweigkofler等(2004)曾试着从基因角度揭示松树脂溃疡病菌与其他近缘种间的差异,相继建立了RAPD、PCR-RFLP以及实时PCR检测方法。然而综观以上方法,有的实验重复性不强,有的难以直接应用于样品检测,有的仪器要求和检测成本较高,口岸实际应用难度极大。本研究的目的是建立一种经济、快速、简便且准确地检测方法,为各口岸开展进境种子、苗木、木材检疫,防止松树脂溃疡病菌传入提供可靠的技术手段。

1 材料和方法 1.1 供试菌株

供试菌株及相关特性见表 1

表 1 供试菌株及来源 Tab.1 Strains tested and their origins
1.2 菌株培养和菌丝体收集

将菌株接于PDA培养基上,20~25 ℃黑暗培养10 d,用接种针将菌丝体轻轻刮下,置于塑料管中,冷冻干燥,加少许石英砂研磨至细粉,-20 ℃下保存。

1.3 基因组DNA的抽提

菌丝体基因组DNA的抽提参照颜子颖等(1998)的CTAB法。孢子基因组DNA的抽提参照Cullen等(1998)的冻融法。

1.4 样品中病原菌基因组DNA的抽提

1) 种子中病原菌基因组DNA的抽提  取20 g松树种子于三角瓶中,加入灭菌水,充分振荡洗涤5 min,取洗涤液于4 000 r·min-1,离心5 min,收集沉淀,冻融法提取病菌DNA,同1.3.2。2)土壤中基因组DNA的抽提    取0.3 g土壤,烘干,充分碾碎,加入0.4%脱脂奶粉,采用冻融法提取病菌DNA,同1.3.2。3)木屑中基因组DNA的抽提    取0.5 g锯木屑,采用冻融法提取病菌DNA,同1.3.2。

1.5 引物设计与合成

根据GenBank中登录Fusarium属31种rRNA基因内间隔区IGS序列,利用引物设计软件(Prime 5.1),设计一对镰刀菌通用引物G1/G2,序列为:5′-GCGGTGTCGGTGTGCTTGTA-3′/5′-ACTCACGGCCACCAAACCAC-3′,一对针对松树脂溃疡病菌的特异引物S1/S2,序列为:5′-CTTACCTTGGCTCGAGAA GG-3′/5′-CCTACCCTACACCTCTCACT-3′。引物合成委托上海基康生物技术有限公司公司完成。

1.6 分子检测体系的建立

第1轮PCR扩增的反应体系为25 μL,反应组分为:10×reaction buffer 2.5 μL,2.5 mmol·L-1 MgCl2 1.5 μL,10 pmol·L-1上下游引物各0.5 μL,10 mmol·L-1 dNTP 2 μL,5 U·μL-1 Taq酶0.25 μL,模板DNA提取液1 μL,灭菌水补足25 μL。以灭菌水代替模板DNA作为阴性对照。混合液在PTC-200 PCR仪上进行扩增,反应程序为:95 ℃变性5 min,进入循环,94 ℃变性30 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,20个循环后72 ℃延伸10 min。

将第1轮PCR扩增产物稀释100倍,取1 μL稀释液作为第2轮扩增的模板。第2轮PCR扩增的反应体系体积为25 μL,反应组分为:10×reaction buffer 2.5 μL,2.5 mmol·L-1 MgCl2 1.5 μL,10 pmol·L-1上下游引物各0.5 μL,10 mmol·L-1 dNTP 2 μL,5 U·μL-1 Taq酶0.25 μL,灭菌水补足25 μL。以灭菌水代替模板DNA作为阴性对照。混合液在PTC-200 PCR仪上进行扩增,反应程序为:94 ℃变性3 min,进入循环,94 ℃变性35 s,66 ℃退火55 s,72 ℃延伸50 s,40个循环后72 ℃延伸12 min。取10 μL扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,EB染色后,于紫外灯下观察,并于凝胶成像系统上检测并拍照。

1.7 灵敏度的测定

将NFUH-3的基因组DNA稀释成5×105、5×104、5×103、5×102、50、5、5×10-1、5×10-2、5×10-3、5×10-4、5×10-5 pg·μL-1等11个浓度梯度,按巢式PCR程序扩增。

将100 μL H2O中的NFUH-3孢子数量分别调成1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10、1个,离心,提取DNA,按巢式PCR程序扩增。

分别在20 g湿地松(Pinus elliottii)种子、0.3 g土壤以及0.5 g木屑中按1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10个等6个梯度加入NFUH-3孢子液,提取DNA,按巢式PCR程序扩增。

取10 μL上述扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,EB染色后,于紫外灯下观察,并于凝胶成像系统上检测并拍照。

2 结果与分析 2.1 松树脂溃疡病菌及其相关种的巢式PCR扩增

巢式PCR第1轮扩增结果表明,供试的17种镰刀菌均可扩增出一条873 bp大小的条带,而阴性对照和其他镰刀属以外的种没有扩增出此条带(图 1)。以第1轮扩增产物为模板,进行巢式第2轮PCR扩增,结果表明,只从松树脂溃疡病菌的4个菌株中扩增出364 bp大小特异性条带,而阴性对照和其他菌株没有扩增出特异条带(图 2)。

图 1 巢式PCR第1轮扩增结果 Fig. 1 The result of nested-PCR first round amplification 1,22.DL 2000 Marker;2.阴性对照H2O Negative control H2O;3.NFUH-1;4.NFUH-2;5.NFUH-3;6.NFUH-4;7.NAUA-1;8.NAUA-2;9.NAUB-1;10.NAUC-1;11.NAUC-2;12.NAUD-1;13.NAUD-2;14.NAUE-1;15.NAUE-2;16.NAUE-3;17.NAUF-1;18.NAUG;19.NAUS;20.JSQP;21.JSQT.下同。The same below.
图 2 松树脂溃疡病菌及其相关种的巢式PCR扩增 Fig. 2 Nested-PCR amplification of F. circinatum
2.2 PCR扩增松树脂溃疡病菌的灵敏度

将NFUH-3的基因组DNA以及100 μL H2O中的孢子稀释成不同浓度梯度,进行巢式PCR扩增,结果显示巢式PCR扩增最低可检测到病原菌DNA浓度为5×10-3 pg·μL-1(图 3),而分生孢子检测的限量为10个·(100 μL)-1 H2O(图 4)。

图 3 PCR扩增松树脂溃疡病菌的灵敏度(Ⅰ) Fig. 3 Nested-PCR using diluted gDNA of F. circinatum (Ⅰ) 1.DL 2000 Marker;2.阴性对照Negative control:H2O;3-13.以NFUH-3 DNA为模板的浓度Concentrations of NFUH-3 DNA:5×105,5×104,5×103,5×102,50,5,5×10-1,5×10-2,5×10-3,5×10-4,5×10-5 pg·μL-1
图 4 PCR扩增松树脂溃疡病菌的灵敏度(Ⅱ) Fig. 4 Nested-PCR using diluted conidia of F. circinatum (Ⅱ) 1. DL 2000 Marker;2.阴性对照Negative control:H2O;3.阳性对照Positive control;NFUH-3 DNA模板浓度Concentration:5 ng·μL-1;4-11.孢子数量Pore number:1×107,1×106,1×105,1×104,1×103,1×102,10,1
2.3 带菌种子中病菌的检测

利用巢式PCR对带菌种子进行检测,结果20 g种子中加入1×106、1×105、1×104、1×103、1×102个孢子的样品均能检测出特异条带,而加入10个孢子的种子没有特异条带(图 5)。

图 5 带菌种子中病菌的检测 Fig. 5 Artificially contaminated seed test 1. DL 2000 Marker;2.阴性对照Negative control:H2O;3.阳性对照Positive control;NFUH-3 DNA模板浓度Concentration:5 ng·μL-1; 4-9.孢子数量Pore number:1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10。下同。The same below.
2.4 带菌土壤中病菌的检测

利用巢式PCR对带菌土壤进行检测,结果0.3 g细土中加入1×106、1×105、1×104、1×103个孢子的样品均能检测出特异条带,而加入100个和10个孢子土样中没有特异条带(图 6)。

图 6 带菌土壤中病菌的检测 Fig. 6 Artificially contaminated soil test
2.5 带菌木屑中病菌的检测

利用巢式PCR对带菌木屑进行检测,结果显示0.5 g木屑中加入1×106、1×105、1×104、1×103、1×102个孢子的样品均能检测出特异条带,而加入10个孢子的木屑中没有特异条带(图 7)。

图 7 带菌木屑中病菌的检测 Fig. 7 Artificially contaminated sawdust test
3 结论与讨论

目前,松树脂溃疡病只在美国、墨西哥、日本、南非、西班牙、智利、海地等地有发现,中国尚未有该病害发生的报道,国内应切实加强进境苗木、种子、木材以及木质包装的检疫。为此,建立松树脂溃疡病菌经济、快速地检测技术势在必行。

基因内间隔区(IGS)是指位于28S rRNA基因3′端与18S rRNA基因5′端之间的序列。通常认为IGS是高变区,为真菌属内种间比较和种内变种及其遗传多样性分析的重要分子标记(Gryta et al., 1997Guidot et al., 1999; Bunyard et al., 1996; Sugita et al., 2001)。张金霞等(2004)以RAPD和IGS为分子标记,研究了中国栽培白灵侧耳(Pleurotus nebrodensis)菌株的遗传多态性,对供试菌株的IGS分析表明,IGS2区域进化较快,菌株间具有丰富的多态性,利用IGS-RFLP可对白灵侧耳菌株进行鉴定。Schweigkofler等(2004)建立的松树脂溃疡病菌实时PCR检测方法也是以IGS为基础的。

采用巢式PCR可明显提高样品检测的灵敏度,最低限量病菌DNA浓度为5×10-3 pg·μL-1,分生孢子10个·(100 μL)-1,该方法检测DNA浓度的灵敏度为Schweigkofler等(2004)建立实时PCR的2 000倍。试验中采用的NFUH-1、NFUH-2、NFUH-3以及NFUH-4分别为美国北卡罗莱那州加勒比松(P. caribaea)、日本琉球松(P. luchuensis)、美国佐治亚州辐射松(P. radiata)、南非展叶松(P. patula)上的分离物,4个松树脂溃疡病菌菌株地理来源广泛。以引物S1、S2对松树脂溃疡病菌及其他对照菌株的DNA进行PCR扩增,电泳的结果只有目标菌的4个菌株可扩增出特异条带,说明引物S1、S2具有较强的特异性。

Dwinell(2006)对松树种子携带松树脂溃疡病菌的研究表明,松种主要以表面带菌为主。因此,本试验采用人工污染种子模拟种子带菌与实际情况基本相吻合。本试验采用冻融法直接从土壤、木屑中提取病菌DNA,可以大大降低病菌孢子过筛过程损耗,避免研磨不充分,最终提高实际检测灵敏度。

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