枇杷(Eriobotrya japonica)是原产我国的特色树种，我国南方主要果树之一，栽培面积已达10万hm²以上，产量已达30万t以上(林顺权等，2004)，超过世界总产量的70%(刘国强等，2000)，因此有关枇杷的研究主要集中在我国。研究分别采用茎尖(杨永清等，1983；万志刚等，2000)、胚(王家福等，2000)、胚乳(彭晓军等，2002)、原生质体(林顺权等，1994；1996；1997；Lin et al., 1995)等类型，其中茎尖培养较为成功，胚乳培养最高再生率为18.04%(彭晓军等，2002)，胚培养多用于种质资源保存(王家福等，2000)。枇杷离体再生目前存在外植体类型单一且再生率低下、培养难度较大等问题，国内外可供参考的研究也较少，建立枇杷离体再生体系难度较大，已成为限制枇杷现代生物技术育种的因素之一，现今未见任何有关枇杷基因转化的报导与此是分不开的。因此有必要进一步拓宽外植体类型，进行其再生系统研究。本研究利用成熟种子子叶及种子苗叶片，试图建立其再生体系。作者在枇杷组织培养中做了大量尝试，多数研究毫无进展，本文所报道的试验结果，实现了成熟子叶和叶片(即使是种子苗叶片)再生报告零的突破，为今后枇杷种子诱变育种获得再生植株以及遗传转化工作打下基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

以浙江省塘栖枇杷‘大红袍’(Eriobotrya japonica cv. Dahongpao)为试材。

1.2 试验方法

1) 枇杷种子的预处理及培养条件  剥开成熟果实取出种子，选大小均一、无伤无虫种子，用GA溶液(设2组浓度，0.5和1.0 mg·L^-1)预处理12 h后剥去种皮，常规消毒后接种在萌发培养基上，先暗培养10 d再在光下培养，于接种后20 d和40 d统计萌发率。并从此处培养的种子苗上不同部位取材，作为进一步培养的外植体。

2) 外植体表面灭菌  用75%乙醇浸泡20~30 s，无菌水冲洗1次，0.1%升汞浸泡8 min后用无菌水冲洗3~4次，无菌滤纸吸干，待用。

3) 成熟子叶切割损伤处理  成熟种子子叶作如下损伤处理：①单瓣子叶；②单瓣子叶并纵向刻伤；③子叶横切分3段。

4) 成熟子叶培养及分化培养基  新鲜种子表面灭菌后进行切割损伤(见1.2.3)处理并接种在子叶诱导培养基上，暗培养20 d后转入光下培养。接种40 d后统计不定芽再生率。分化培养基以MS为基本培养基，选用TDZ和GA植物生长调节剂组合。TDZ浓度固定在3.0 mg·L ^-1，GA设3个浓度(0、0.3和0.5 mg·L^-1)；GA浓度固定在0 mg·L^-1，TDZ设3个浓度(3.0、4.0和5.0 mg·L^-1)。

5) 种子苗叶片培养及分化培养基  从种子苗上取已完全展开的叶片剪除叶缘并切成3部分(叶尖、叶中部和近叶柄端)，接种在基本培养基为MS、附加植物生长调节剂的培养基上。植物生长调节剂配比分为2组：①NAA固定在0.1 mg·L^-1，TDZ设5个浓度(0、2.5、3.5、4.5和5.5 mg·L^-1)；②NAA浓度固定在0.5 mg·L^-1，TDZ设5个浓度(0、2.5、3.5、4.5和5.5 mg·L^-1)。

以上培养基均附加蔗糖2%，琼脂7.5 g·L^-1，调pH为5.8。121 ℃高压灭菌20 min。培养基中所用植物生长调节剂NAA、BA和GA采用高压灭菌，TDZ采用过滤灭菌。外植体培养温度为(26±1)℃，光下培养条件均为光照强度2 000~3 000 lx，光暗周期16 h/8 h。所有处理20个外植体，重复3次。

6) 统计分析  试验结果参考李春喜等(1997)的方法分析。百分数进行反正弦转化后用SAS统计软件包分析方差(SAS Inst., Cary, N.C.)。

2 结果与分析 2.1 GA预处理对萌发率的影响

去皮的枇杷种子接种在培养基上1周后就有个别萌发，10 d后移到光下大部分快速变绿并迅速生长。GA预处理后20 d萌发率分别达到85.7%和80.0%，远远高于未经GA处理的对照组，但到40 d时其萌发率略高于对照，与CK间无较大差异。另外GA处理的种子苗发育健壮，根和茎明显比CK组幼苗粗壮。这说明GA处理对最终的萌发率影响不大，但可以促进枇杷种子萌动，促使种子提早萌发，并形成健壮小苗。

2.2 子叶切割方式及培养基对成熟子叶再生的影响

为了获得成熟子叶再生，成熟子叶接种在多组培养基上，但在试验范围内其只在Z₁—Z₅号培养基上获得分化，且Z₁—Z₅上分化率不同，其中横切子叶在Z₅上获得最高再生率83.3%。随Z₅—Z₁培养基中TDZ浓度升高，3种外植体类型的再生率均呈上升趋势；但当TDZ最大浓度至5.0 mg·L^-1时，分化者表现畸形、玻璃化现象，因此TDZ浓度不应再升高。以子叶横切者为外植体试验培养基中添加GA对培养效果的影响，结果显示添加GA能显著提高子叶横切外植体的再生率，但2组浓度间差异不显著，且当GA浓度为0.5 mg·L^-1时，再生率略高于GA 0.3 mg·L^-1时，若进一步提高GA的浓度会不会提高再生率有待以后的研究。

外植体类型不同，再生率有差异，切割方式不同其最适培养基不同(图版Ⅰ-1~5)。在Z₁—Z₃培养基上，单瓣子叶比子叶横切和单瓣子叶并纵向刻伤再生率高。表中所示外植体均为带胚芽子叶，相同培养基上，不带胚芽子叶在切口处有大量愈伤组织，但未有不定芽产生。这说明胚芽对枇杷成熟子叶的再生具有决定性的作用。

同时3种切割方式的子叶接种到BA 0.5和1.0 mg·L^-1(NAA均为0.4 mg·L^-1)的MS培养基上，带胚芽外植体表现为胚芽萌发。

2.3 NAA和TDZ对枇杷叶片不定芽诱导的影响

试验中，叶尖和叶片中部仅产生了愈伤组织，未有不定芽发生，将此愈伤组织从叶片外植体上剥下接种到分化培养基中进行分化培养但仍未有不定芽分化(图版Ⅰ-6)。近叶柄端培养先产生白色的愈伤组织，后愈伤组织发育成绿色，从绿色的愈伤组织分化出不定芽，不定芽可以继续生长(图版Ⅰ-7~11)。由表 3可见，所有不定芽发生均产生于叶柄端，培养基中的NAA和TDZ对不定芽的发生有较大影响。当NAA为0.5 mg·L^-1时，仅在TDZ为3.5 mg·L^-1时产生1个不定芽；当NAA为0.1 mg·L^-1时，TDZ为2.5和3.5 mg·L^-1时分别产生了13个和10个不定芽，不定芽发生分别占近叶柄端外植体的65.0%和50.0%；当NAA为0 mg·L^-1时，所有供试外植体在附加TDZ培养基上的分化率并未增加。

3 讨论

木本果树分化培养因无性材料培养的高难度，不易获得再生，多采用有性材料，如胚(尤其是幼胚)、胚乳、子叶等，无性材料如叶片的分化报告较少。如桃(Amygdalus persica)(吴延军等，2005)、黑核桃(Juglans nigra)(Lynn et al., 1995)、苹果(Malus pumila)(Daigny et al., 1996)，也常采用有性材料，建立再生体系并用于基因转化或其他方式的育种中(Cheng et al., 1997；Roichev，2000；Höfer，2004)。为了提高无性再生的可能性，在一些试验中也使用种子苗不同部位进行研究，枇杷现有报告也是围绕胚、胚乳等有性材料，尚未有任何来源的叶片再生报告。在获得种子苗后，作者取其茎尖、带侧芽茎段、幼茎节间、叶片和根等材料，采用多种放置方式培养在多种培养基上，但也仅有本文列出的结果，植物生长调节剂组合如TDZ+IBA、BA+IBA等，外植体类型如根、茎间均无不定芽分化。茎尖和带侧芽茎段芽体可在供试培养基上继续生长，添加TDZ则芽体过于膨大，茎也表现为粗、松并呈现畸形。因此若以快繁为目的，则茎尖和带侧芽茎段可培养在含有BA+NAA的培养基上。幼茎节间和根培养获得愈伤组织，尤其是根培养极易产生愈伤组织，但此愈伤组织无不定芽分化。这说明不同的外植体组织类型及生理发育状态、植物生长调节剂种类及浓度对枇杷的再生有较大影响，有待下一步试验继续探讨。

种子苗叶片培养中，不定芽产生于近叶柄处，而在中部及叶尖处没有分化不定芽，近叶柄端的再生能力强于叶片的其他部位，这与其他树种相似(Mezzeti et al., 1997)。叶片产生的愈伤组织分化试验未获得不定芽分化，在下一步的试验中将针对叶龄及来源于叶片的愈伤组织作进一步的试验。